徠卡THUNDER成像系統在探索微生物腸道免疫機制的應用
由SARS-CoV-2冠狀病毒引起的Covid-19影響了世界的方方面面。免疫和治療方法等抗病毒方向的研究在2020年具有高優先級，顯微鏡在這類研究中起著舉足輕重的作用。了解受體結合、基因組釋放、復制、組裝和病毒出芽的基本原理及免疫應答，可以使用不同的方法和顯微鏡。鑒于顯微鏡在感染生物學中的重要作用，我們舉例闡述不同的顯微技術及其在這些研究領域中的應用。
微生物-腸-腦軸是將大腦和腸道功能整合的雙向信息交流系統，并涉及神經、免疫和內分泌機制。除了神經內分泌系統和神經免疫系統之外，該軸還包括了中樞神經系統（CNS）、自主神經系統（ANS）的交感神經和副交感神經分支以及腸道神經系統（ENS）。從腸道到CNS的傳入纖維（如大腦、扣帶回、小腦扁桃體和扁桃體皮質）以及腸道平滑肌的效應纖維是沿著微生物-腸-腦軸進行雙向信息交流的主要途徑。
圖1 微生物-腸-腦軸
腸道神經系統（ENS）遍布腸道組織的每個角落，將收集到的信息迅速地傳遞到自體或非自體類型的細胞，織就一個龐大又復雜的網絡系統。新涌現的多個研究報道發現ENS可以作為免疫系統的感應平臺，但對ENS與上皮細胞的互作機制還知之甚少。
2019年12月，Jarret等人在Cell發表了題為Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity的文章。借助單分子mRNA熒光原位雜交（smFISH; THUNDER Imager 3D Live Cell），研究發現ENS神經元分泌IL-18作用于腸道上皮細胞中的杯狀細胞，促進杯狀細胞抗菌蛋白（AMP）的表達，在腸道免疫中起著重要作用。
圖2 ENS與腸道上皮細胞互作機制
研究過程
圖3 THUNDER驗證結果與Confocal觀察結果一致
A）用于分析IL-18+神經元的Confocal正交視圖。IL-18（紅色），Tubb3（綠色）。
B）通過smFISH觀察野生型與IL18-/-小鼠結腸中的IL18 mRNA（白色）和DAPI（藍色）。
同時通過smFISH檢測小鼠腸組織中IL18與Tubb3的表達，觀察到IL18 mRNA探針與神經元特異性Tubb3 mRNA探針共定位。
圖4 smFISH檢測小鼠腸組織中IL18（紅色）、Tubb3（白色）表達；DAPI（藍色）表示細胞核
總之，這些數據表明腸神經元是結腸中IL-18的新產生者。研究還結合了單細胞轉錄組技術來探究ENS來源IL-18的功能以及作用方式。
看到這里大家可能會有一個疑問：為什么不用共聚焦做smFISH而是選擇徠卡THUNDER？對，為什么？小編也提出過這個問題，但是下面這段話做出了很好地解釋。
smFISH的實驗過程中探針會發出大量光子，而共聚焦則會顯著限制光子收集的數量，為了最大限度回收這些光子，更建議使用寬場技術。
徠卡THUNDER憑借其高分辨、快速、大視野的特點，可大限度回收實驗中smFISH探針發出的大量光子，減少光損耗，更適用于smFISH成像。不僅可以獲得清晰銳利的圖像，實驗結果更便于統計分析且重復性高，是您進行組織大視野快掃的不二之選。
參考文獻
研究背景
人類出生后胃腸道立刻被復雜的微生物群落定植（1000余種，且數量>100萬億），而這些腸道微生物群落影響宿主生理的多個方面，包括代謝、免疫反應、行為和晝夜節律等等。先前的研究認為腸道微生物群落主要是共生菌，共生菌可控制病原菌數量，而黏膜屏障免疫對于維持共生菌群和抵抗侵入性細菌感染至關重要。
微生物-腸-腦軸是將大腦和腸道功能整合的雙向信息交流系統，并涉及神經、免疫和內分泌機制。除了神經內分泌系統和神經免疫系統之外，該軸還包括了中樞神經系統（CNS）、自主神經系統（ANS）的交感神經和副交感神經分支以及腸道神經系統（ENS）。從腸道到CNS的傳入纖維（如大腦、扣帶回、小腦扁桃體和扁桃體皮質）以及腸道平滑肌的效應纖維是沿著微生物-腸-腦軸進行雙向信息交流的主要途徑。
圖1 微生物-腸-腦軸
腸道神經系統（ENS）遍布腸道組織的每個角落，將收集到的信息迅速地傳遞到自體或非自體類型的細胞，織就一個龐大又復雜的網絡系統。新涌現的多個研究報道發現ENS可以作為免疫系統的感應平臺，但對ENS與上皮細胞的互作機制還知之甚少。
2019年12月，Jarret等人在Cell發表了題為Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity的文章。借助單分子mRNA熒光原位雜交（smFISH; THUNDER Imager 3D Live Cell），研究發現ENS神經元分泌IL-18作用于腸道上皮細胞中的杯狀細胞，促進杯狀細胞抗菌蛋白（AMP）的表達，在腸道免疫中起著重要作用。
圖2 ENS與腸道上皮細胞互作機制研究過程
鑒于大腦中神經元會分泌IL-18，而大量研究表明ENS可能在調節粘膜屏障免疫中發揮關鍵作用，因此研究人員大膽猜測腸道神經元也會分泌IL-18。接下來作者構建ENS特異性敲除IL-18小鼠和多種細胞類型特異性敲除IL-18R小鼠，并分別用鼠傷寒沙門氏菌(S.t)感染。之后作者通過共聚焦觀察發現不攜帶ENS所產生的IL-18的小鼠則更容易受到感染。為了證實這一發現，研究人員使用了IL18 mRNA探針在小鼠中進行了單分子mRNA熒光原位雜交（smFISH），結果顯示在IL-18-/-小鼠結腸中IL18 mRNA探針的信號丟失。
圖3 THUNDER驗證結果與Confocal觀察結果一致A）用于分析IL-18+神經元的Confocal正交視圖。IL-18（紅色），Tubb3（綠色）。
B）通過smFISH觀察野生型與IL18-/-小鼠結腸中的IL18 mRNA（白色）和DAPI（藍色）。
同時通過smFISH檢測小鼠腸組織中IL18與Tubb3的表達，觀察到IL18 mRNA探針與神經元特異性Tubb3 mRNA探針共定位。
圖4 smFISH檢測小鼠腸組織中IL18（紅色）、Tubb3（白色）表達；DAPI（藍色）表示細胞核總之，這些數據表明腸神經元是結腸中IL-18的新產生者。研究還結合了單細胞轉錄組技術來探究ENS來源IL-18的功能以及作用方式。
實驗方法
- 處死小鼠，移出結腸并用冷PBS沖洗。縱向剖開結腸組織平鋪于濾紙。
- 用4％多聚甲醛PBS溶液固定3小時，后置于30％蔗糖、4％PFA的PBS溶液中4℃過夜。
- 包埋，制成將7mm厚切片，并用于smFISH染色。
- 設計的探針庫與Cy5（IL-18）、TMR（Tubb3）結合，將切片與smFISH探針庫雜交。
- 封片前去除ENS內的自發熒光信號。
- 在Leica THUNDER Imager 3D Live Cell上進行smFISH成像，使用自帶的THUNDER Computational Clearing設置。
看到這里大家可能會有一個疑問：為什么不用共聚焦做smFISH而是選擇徠卡THUNDER？對，為什么？小編也提出過這個問題，但是下面這段話做出了很好地解釋。
smFISH的實驗過程中探針會發出大量光子，而共聚焦則會顯著限制光子收集的數量，為了最大限度回收這些光子，更建議使用寬場技術。
徠卡THUNDER憑借其高分辨、快速、大視野的特點，可大限度回收實驗中smFISH探針發出的大量光子，減少光損耗，更適用于smFISH成像。不僅可以獲得清晰銳利的圖像，實驗結果更便于統計分析且重復性高，是您進行組織大視野快掃的不二之選。
參考文獻
- Jarret et al., 2020, Cell 180, 50–63
- Brain Res. 2018 August 15; 1693(Pt B): 128–133
- Jung, Y. J.,et al., 2017, Sci Rep 7(1):17360
- Zhang, H., et al. 2018, Synth Syst Biotechnol 3(2): 113-120
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