如今，結核病仍是世界頭號的傳染病殺手。2018年，全世界估計有1000萬人新患上結核病，并有150萬人因此喪生。引起結核病的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）通過呼吸道入侵人體并引起肺部病變。通常，宿主的免疫系統會識別并清除結核分枝桿菌，以防止感染的進一步擴散。然而，這種細菌并不是那么容易對付的，它會想方設法逃避宿主免疫系統的監視。至于它是如何逃逸的，現在人們還沒有完全弄清楚。

重慶大學吳海波課題組近日通過調節宿主miR-325-3p的表達，發現了結核分枝桿菌新的免疫逃逸途徑。這不僅有助于了解結核分枝桿菌的免疫逃逸，還為耐藥結核病的療法開發提供了理論基礎。這項成果于2020年6月發表在mBio雜志上。

01 miR-325-3p與結核分枝桿菌的存活有關

吳海波課題組之前的研究表明，小鼠被結核分枝桿菌氣溶膠感染后，microRNA-325-3p（miR-325-3p）的表達上調。同樣地，他們發現與健康對照相比，潛伏性結核病患者的miR-325-3p水平更高，表明這種miRNA在結核分枝桿菌的存活中發揮重要作用。

為了確定miR-325在結核分枝桿菌感染中的作用，研究人員首先以感染結核分枝桿菌的RAW 264.7巨噬細胞為對象，分析了miR-325轉錄本的表達水平。他們發現，pri-miR-325、pre-miR-325和miR-325-3p的表達水平在感染后均增加。同時，小鼠骨髓來源的巨噬細胞（BMDM）在感染后24小時也觀察到miR-325-3p的上調。

之后，他們又用miR-325-3p模擬物和抑制物來轉染RAW 264.7細胞。結果表明，在模擬物存在時，結核分枝桿菌的存活率得到了提高。相反，經過抑制物處理后，結核分枝桿菌的存活受損。與野生型小鼠相比，Mir325敲除小鼠在感染結核分枝桿菌后的中位生存期顯著延長。這些數據表明，miR-325-3p在結核分枝桿菌感染后上調，且不利于宿主形成對結核分枝桿菌的抵抗力。

02 LNX1是miR-325-3p的直接靶點

接下來，研究人員分析了miR-325-3p在結核分枝桿菌感染期間是否靶向和調節特定的基因。他們通過數據庫預測了miR-325-3p的靶點，并選擇Lnx1開展進一步的研究。Lnx1的3’ UTR中含有miR-325-3p的特異性結合位點。他們將Lnx1的3’ UTR及其突變體克隆到熒光素酶報告載體后，與miR-325-3p模擬物一起轉染到HEK293T細胞中。他們發現野生型3’ UTR中的熒光素酶活性下調，而突變體則沒有下調。

為了進一步證實miR-325-3p在調節LNX1中的作用，研究人員又通過Western blotting評估了LNX1的表達水平。結果顯示，LNX1在miR-325-3p模擬物存在時受到抑制，而在miR-325-3p抑制物存在時上調。他們接著用γ射線照射的結核分枝桿菌來感染野生型小鼠的BMDM細胞以及RAW 264.7細胞，發現感染阻止了兩種巨噬細胞中LNX1的表達，但來源于Mir325缺陷型小鼠的BMDM中卻未出現這種現象。這些結果表明，miR-325-3p靶向LNX1，抑制其在結核分枝桿菌感染期間表達。

03 LNX1促進NEK6的多聚泛素化

那么，LNX1在結核分枝桿菌感染期間發揮了什么樣的作用？研究人員首先利用酵母雙雜交系統來篩選LNX1的相互作用蛋白。通過軟件預測和Western blotting篩選，他們選擇了NEK6，這是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在幾種組織中普遍表達。他們發現，NEK6的變化與LNX1呈負相關。體外和體內的實驗均表明，LNX1是NEK6的負向調控分子。

之后的免疫共沉淀和體內pulldown實驗結果表明，LNX1與NEK6之間存在著直接的相互作用。他們還發現，miR-325-3p過表達抑制了NEK6-LNX1相互作用，而miR-325-3p抑制則增強了這種相互作用。由于LNX1與NEK6之間存在反向關聯，故研究人員分析了LNX1存在或不存在時的NEK6多聚泛素化。后續研究表明，LNX1是一種E3泛素連接酶，它直接與NEK6結合，并促進NEK6的多聚泛素化以及蛋白酶體介導的降解。

04 NEK6通過激活STAT3而抑制細胞凋亡

接下來，研究人員進一步研究了NEK6在結核分枝桿菌存活中的特定作用。由于NEK6是一種靶向STAT3的蛋白激酶，因此他們首先關注了結核桿菌感染期間STAT通路的調控。在感染24小時后，STAT3的磷酸化水平上調。而Nek6敲除小鼠（賽業生物構建）的BMDM和器官中則表現出相對較低的STAT3磷酸化水平。

眾所周知，STAT3是一種轉錄激活因子，可響應細胞刺激介導多個基因的表達，在許多細胞進程（如凋亡和免疫應答）中起關鍵作用。因此研究人員測試了下游可以直接由STAT3調控的基因。野生型小鼠的BMDM在被結核分枝桿菌感染期間，抗凋亡BCL-2基因家族的表達上調，而Nek6敲除小鼠的BMDM則沒有這種現象。因此，NEK6充足的巨噬細胞表現出凋亡抑制作用，這有利于結核分枝桿菌在細胞內存活。如此看來，NEK6通過STAT3的磷酸化調控先天免疫應答，并參與結核分枝桿菌感染期間的細胞凋亡調控。

綜上所述，研究人員通過調節宿主miR-325-3p的表達而發現了結核分枝桿菌新的免疫逃逸途徑：miR-325-3p靶向LNX1并阻礙了巨噬細胞中NEK6的蛋白酶體降解，NEK6的異常積累導致STAT3信號的激活，從而使細胞凋亡受到抑制，并促進結核分枝桿菌在細胞內存活。

miR-325-3p促進結核分枝桿菌免疫逃逸的示意圖

原文檢索：

Fu B, Xue W, Zhang H, Zhang R, Feldman K, Zhao Q, Zhang S, Shi L, Pavani KC, Nian W, Lin X, Wu H. 2020. MicroRNA-325-3p facilitates immune escape of Mycobacterium tuberculosis through targeting LNX1 via NEK6 accumulation to promote anti-apoptotic STAT3 signaling.

DOI：https://doi.org/10.1128/mBio.00557-20.