影響RT-PCR的因素和反轉(zhuǎn)錄引物的選擇
反轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)，改變一點(diǎn)點(diǎn)，實驗大反轉(zhuǎn)！
科研黨們整天都在為提取RNA而煩惱，費(fèi)盡九牛二虎之力，終于！RNA質(zhì)量完美！可是。。。qPCR/PCR結(jié)果依然不好，咋整?！
在做qPCR/PCR實驗之前，必不可少的一步就是反轉(zhuǎn)錄。別小看它哦，它在整個實驗流程中發(fā)揮著重要作用！
反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription ）是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)（圖1）。
圖1
影響RT-PCR的因素主要可以概括為以下幾點(diǎn)：
1） RNA的質(zhì)量
反轉(zhuǎn)錄必須保證實驗使用的RNA質(zhì)量（如圖2所示）：瓊脂糖電泳膠圖包括28S和18S兩條清晰明亮的條帶（真核樣品），且28S/18S≈2:1，A260/280≈2.0，泳道無彌散區(qū)、無基因組、蛋白污染等。
圖2 思科捷貨號：AC0307，樣本：玉米種子
2） 反轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性
常規(guī)反轉(zhuǎn)錄酶發(fā)揮作用的最佳溫度在42℃左右，但常規(guī)溫度很難打開復(fù)雜模板中的二級結(jié)構(gòu)，直接阻礙cDNA的繼續(xù)合成；選擇熱穩(wěn)定性高的反轉(zhuǎn)錄酶，可以在高溫打開復(fù)雜模板中二級結(jié)構(gòu)的同時發(fā)揮作用，極大的提高了復(fù)雜模板的反轉(zhuǎn)錄效率（圖3）。
圖3
3） 反轉(zhuǎn)錄引物的選擇
反轉(zhuǎn)錄實驗可供選擇的引物主要包括3種，其各自特征及優(yōu)缺點(diǎn)如下表所示。可見，根據(jù)后續(xù)實驗的不同要求，需要選擇合適恰當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗，這同樣也是反轉(zhuǎn)錄PCR中重要的一環(huán)。
表1
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引物類型 |
特征 |
優(yōu)勢 |
劣勢 |
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Oligo dT或
錨定Oligo dT |
Oligo dT引物適用于識別mRNA末端的Poly A尾；
錨定Oligo dT在3’端包括G、C或A殘基。 |
可從含Poly A尾的mRNA合成全長cDNA;
錨定堿基保證了引物結(jié)合在Poly A 5’端。 |
只能擴(kuò)增含有Poly A尾的mRNA，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高。 |
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隨機(jī)引物 |
含6-9個堿基，可隨機(jī)識別并在退火時結(jié)合在模板RNA上。 |
可同所有類型的RNA結(jié)合；適合于含有二級結(jié)構(gòu)RNA，或微量樣本；得率高。 |
產(chǎn)物來自所有RNA模板，可能會對目的片段造成稀釋；cDNA小片段較多。 |
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序列特異性
引物 |
識別特定模板序列 |
產(chǎn)物特異性及反應(yīng)靈敏度高。 |
只能合成特異性的某條序列。 |
圖4
當(dāng)所有試劑準(zhǔn)備就緒，即可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄體系的配制。常規(guī)的RT-PCR體系的配制需要加入引物、模板、反轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor、RT Buffer、dNTP、RNase-free H2O等等試劑，操作步驟繁瑣復(fù)雜。
那么，重點(diǎn)來啦！！
思科捷AG0304試劑盒為一管式反轉(zhuǎn)錄預(yù)混 Mix，其中2×SPARKscript Ⅱ RT Plus Master Mix 中含有反轉(zhuǎn)錄第一鏈合成所需的所有試劑（SPARKscript Ⅱ Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random Primer、Oligo（dT）Primer、dNTP Mixture、Buffer），其中特別優(yōu)化了Oligo dT和N6隨機(jī)引物的配比，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄的各個區(qū)域起始并具有相同的反轉(zhuǎn)錄效率，最大程度保證后續(xù)實驗結(jié)果的真實性和可重復(fù)性；此外，試劑盒中還包含具有 DNA 分解活性的特殊 gDNA Eraser Mix，5 分鐘消除 gDNA 殘留，不需要 DNase 消化或更多繁瑣步驟。
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（同時搭配思科捷RNA提取試劑Trizol （AC0101）和qPCR試劑（AH0104）效果更棒呢！）
思科捷小彩蛋：
如何證明RNA反轉(zhuǎn)錄是否成功？
因為cDNA 是長短不一的 DNA 片斷混合物，所以電泳的結(jié)果大多是模糊一片的，如果 RNA 豐度較低，電泳也可能是無產(chǎn)物，但是這種情況并不代表 PCR 會無結(jié)果。檢測 cDNA 可以用定量的方法首先看一下內(nèi)參有沒有擴(kuò)增出來，內(nèi)參有結(jié)果，cDNA 的質(zhì)量基本上可以保證。但能擴(kuò)增出內(nèi)參，不一定就說明 cDNA 沒有問題。因為內(nèi)參在 cDNA 中豐度高，很容易擴(kuò)出。如果 cDNA 存在部分降解，從機(jī)率的角度講，就會大大影響低豐度的目的基因的 PCR 結(jié)果，而內(nèi)參因為依然是高豐度，擴(kuò)增很可能不受影響。有些 GC 含量高， 二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的 RNA 模板，低溫很難將二級結(jié)構(gòu)打開，使用普通的逆轉(zhuǎn)錄酶很難奏效，此時可以選擇思科捷AG0304，該酶可耐受高至 55℃高溫，能夠高效反轉(zhuǎn)錄多種 RNA 模板，最大限度將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 第一鏈。
圖5 采用思科捷AG0304和競品品牌V分別對RNA1、RNA2進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，思科捷AH0104進(jìn)行qPCR，獲得擴(kuò)增曲線如圖所示，CT（AG0304反轉(zhuǎn)獲得的cDNA）＜CT（某品牌V反轉(zhuǎn)獲得的cDNA） ，可見思科捷AG0304的反轉(zhuǎn)錄效率高于某品牌V。
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反轉(zhuǎn)錄
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