細胞凍存與復蘇小課堂

瀏覽次數：4527　發布日期：2019-8-15　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

電影《太空旅客》里，未來的地球人搭太空船移民其他星球，上百年的飛行時光中，人們躺到休眠艙里保存有限的生命，男主角 Jim 是其中一名乘客，卻意外提早了 90 年起床，故事就由此開始。
相信做過長期細胞實驗的各位都知道，凍存細胞很重要，就像知道未來星際旅行要躺到休眠艙里睡覺一樣！但，你明白其中的道理嗎？

細胞凍存的好處

節省實驗室空間、我們的時間和老師的經費。
給失敗的實驗，多幾次洗心革面的機會。
確保重復實驗的一致性。
確保未來實驗的連接性。

所以這看似小小的一步，其實非常重要啊！

細胞凍存的基本原理：

細胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與，而這些蛋白酶在環境溫度低于-70℃ 以下時會集體罷工，使代謝活動近乎停止，細胞因此進入睡美人狀態，使細胞「不會老」，所以可以長期保存。冷凍凝固的過程中，水分會在 0℃～-20℃ 區間形成不同形狀的結晶「下圖 1」，因此在細胞凍存時「降溫速度、冰晶形成量和細胞滲透壓改變程度」是影響凍存成功與否的重要關鍵。

▲圖1：0℃~-20℃ (紅色區)，冰晶生成量最多。(Fesenmaier,2011)

■　降溫速度慢：冰晶由細胞外開始形成，造成胞外滲透壓變小，細胞內水份移動至細胞外，造成細胞脫水皺縮。
■　降溫速度快：水分流動時間短，細胞內外滲透壓改變程度小，但大量水分留在細內造成大量胞內冰晶形成，使胞器損壞。

這些影響都會讓細胞損傷、細胞凋亡或壞死，也可能造成復蘇后細胞存活率低、細胞形態改變、細胞功能喪失、基因或蛋白質組分變異等現象。由此可知，最適合的凍存條件為「在增加細胞滲透壓穩定性的溶液中，以慢到能減少胞內冰晶形成、但也足夠快到能預防細胞脫水的降溫速度凍存細胞」「下圖２」。

▲圖２：降溫速度對細胞造成的影響

最溫柔的凍存液：

細胞凍存液體中的「抗凍劑」是維持細胞滲透壓平衡的關鍵，常見的成分有 DMSO、甘油等。這些成分能在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內，平衡細胞內外的滲透壓，避免細胞過分脫水皺縮、也能同時減少細胞內冰晶的形成；但這類成分對細胞有一定的毒性，所以需要使用高濃度血清來保護細胞，使凍存成本升高。而目前市面上常見的無血清細胞凍存液，會是對細胞最溫柔的替代選擇。

剛剛好的凍存方法：

上課快遲到時，嫌公交車速度太慢；送曖昧對象回家時，嫌走路速度太快。到底怎樣的降溫速度對細胞最好？經研究證實：最佳降溫速度為 -1℃/分鐘；以下介紹三種常見凍存方法：

手動程序降溫：最傳統的降溫法，將細胞依序放在 4℃（30 分鐘）、-20℃（1 小時）、-80℃（過夜）；操作過程耗時久，容易做到一半就忘記。
程序冷凍儀：簡單來說就是特殊設計冷庫，內建程序能準確控溫，使細胞以每分鐘-1℃ 的速度降至-135℃。
程序降溫盒：一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充二甲基甲醇或依靠特制金屬導熱），使細胞以每分鐘約-1℃ 的速度降至-80℃。

快狠準地叫醒細胞：

將凍存在-196℃ 液態氮中的細胞凍存管快速移至已 37℃ 預熱的水浴鍋中（水面需低于管口，避免水分意外進入凍存管），使細胞冷凍懸液迅速融化；此做法能讓細胞冷凍懸液快速通過-20℃～0℃ 這個結晶形成溫度范圍（圖 1），使凍存時細胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶進入細胞形成再結晶，對細胞造成二次傷害。細胞復蘇速度太慢，就會像艦長一樣「醒來卻一身病」，電影全程出現不到半小時就下去領盒飯啦！

最后祝各位穿越時空的細胞, 都能像電影主角一樣擁有美麗結局。

Reference

Fesenmaier K: Caltech Physicist Explains Why Snowflakes Are So Thin and Flat, 2011
CryopreservationGuide: The basics of cellular cryopreservation for research & clinicaluse., Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd., 2017

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