檢測肝癌細胞基因表達的實驗方法！
 
材料與方法
 
⒈材料
 
人肝癌細胞系HepG2由中國醫科大學科學實驗中心保存。DMEM培養基和胎牛血清購自BioInd公司。細胞轉染試劑Lipofectamine 3000和Trizol購自Invitrogen公司。BDNF AS質粒、BDNF AS與BDNF基因完全互補序列缺失突變質粒以及空載體質粒購自上海和元生物公司。無內毒素質粒中提試劑盒購自天根生化科技公司。GoScript TM Reverse Transcription System反轉錄試劑盒和GoTaq ® qPCR Master Mix試劑盒購自Promega公司。BDNF AS和BDNF引物購自Origene公司。BDNF兔抗人一抗和GAPDH引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。β-actin小鼠抗人一抗和羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術公司。BCA蛋白質含量檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司。
 
Alexa Fluor ® 594驢抗兔熒光二抗購自Thermo Fisher Scientific公司。Quantikine ®  ELISA Human BDNF Immunoassay試劑盒購自R&D Systems公司。FISH試劑盒以及Cy5標記的lncRNA BDNF AS探針和Cy3標記的BDNF mRNA探針由Creative Bioarray公司設計并合成, 其中, BDNF AS探針既能檢測內源也能檢測外源轉入的lncRNA BDNF AS。
 
⒉實驗方法
 
⑴細胞培養和轉染
 
肝癌細胞HepG2使用含有10%胎牛血清的DMEM培養基, 37 °C、5% CO2條件培養。采用細胞轉染試劑Lipofectamin 3000轉染, 將BDNF AS質粒、BDNF AS與BDNF基因完全互補序列缺失突變質粒以及空載體質粒分別瞬時轉染HepG2細胞, 轉染過程按試劑說明書進行, 簡述如下。轉染前24 h給細胞傳代, 保證轉染時細胞達到90%融合。用Opti-MEM稀釋Lipofectamine 3000, 同時, 用Opti-MEM稀釋質粒DNA后加入P3000混勻。
 
將稀釋好的DNA和Lipofectamin 3000混合, 室溫孵育5 min后加入細胞, 繼續培養48 h用于下述實驗。細胞實驗至少重復3次。
 
⑵qPCR方法檢測lncRNA BDNF AS和BDNF mRNA水平
 
Trizol提取細胞總RNA, 紫外分光光度計測定RNA濃度和純度, 取5 μg總RNA反轉錄成cDNA。qPCR應用Roche LightCycler 480 Real-time PCR擴增儀完成, 按照試劑盒提供的操作說明書進行。BDNFAS引物序列分別為F: 5′-TAC CAC AAG GTA CCA
ACC ATA TAT G-3′, R: 5′-CAT GTG GTT CTG TTT CAA TGC CC-3′, PCR產物長度135 bp。BDNF引物序列分別為F: 5′-CAT CCG AGG ACA AGG TGG CTT G-3′, R: 5′-GCC GAA CTT TCT GGT CCT CATC-3′, PCR產物長度161 bp。反應條件為: 95℃預變性2 min; 95℃擴增15 s, 60℃退火1 min, 共40個循環。以GAPDH作為內參, 采用2 –ΔΔCt 方法進行數據分析。
 
⑶ Western blot方法檢測BDNF蛋白質水平
 
細胞加入RIPA細胞裂解液和蛋白酶抑制劑, 置于冰上裂解。4℃條件下離心, 取上清, 按BCA試劑盒說明測定蛋白質濃度。取80 μg總蛋白, 采用12%SDS-PAGE分離, 并轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后, 分別用兔抗人BDNF和小鼠抗人β-actin(1)002 4抗-4℃孵育過夜, 然后用山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(1 2育孵溫室)000 2發LCE ,h׃光成像。采用Image Pro-plus 6.0軟件測定每個蛋白條帶的積分光密度值, 計算同一個樣品BDNF和β-actin積分光密度之間的比值, 作為BDNF的相對表達量。
 
⑷ELISA方法檢測培養上清中BDNF蛋白質水平
 
離心收集細胞上清液用于檢測BDNF蛋白質水平。ELISA實驗操作按照試劑盒說明進行, 簡述如下。50 μL待測樣品或標準品用100 μL檢測稀釋液稀釋后, 加到孔板中室溫孵育2 h, 加入100 μLBDNF偶聯抗體室溫孵育1 h, 加入200 μL底物溶液顯色。多功能酶標儀校正波長設定570 nm, 于450 nm波長處讀取吸光度值。
 
⑸免疫熒光染色觀察BDNF蛋白質水平
 
PBS漂洗細胞, 用4%多聚甲醛室溫固定, 5% BSA封閉后,向細胞中滴加兔抗人BDNF一抗(1抗驢及)釋稀002׃兔熒光二抗(Alexa Fluor 594), DAPI復染細胞核, 熒光顯微鏡觀察并采集圖像, 采用Image Pro-plus 6.0軟件測定細胞的平均光密度值。
 
⑹FISH方法檢測lncRNA BDNF AS和BDNF mRNA水平和定位
 
FISH實驗操作按照試劑盒說明進行, 簡述如下。分別用0.2 mol/L HCl和0.3%Triton X-100室溫孵育細胞, 4%多聚甲醛室溫固定細胞后, 向細胞中滴加RNA雜交緩沖液, 55℃預雜交2 h。將RNA探針(探針用雜交緩沖液1)釋稀002׃于85℃變性5 min, 37℃保持2 min。向細胞中滴加探針, 橡膠膠水封片, 在37℃濕盒中避光雜交過夜。
 
DAPI復染細胞核, 激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000,Olympus)采集圖像, 采用Image Pro-plus 6.0軟件測定細胞的平均光密度值。
 
⒊統計學分析
 
實驗采用SPSS 13.0軟件處理數據。One-WayANOVA分析用于比較不同處理組細胞之間的差異,組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果用均值±標準差表示, P<0.05為差異有統計學意義。

北京百歐博偉生物技術有限公司自設細胞系板塊，是細胞株提供中心,專業提供代次低、周期短、活性好的細胞株。與國內外多家研制單位，生物醫藥，第三方檢測機構，科研院所有著良好穩定的長期合作關系！歡迎廣大客戶來詢！
http://www.biobw.com/