生物藥品活性成分常用檢測方法及局限性

隨著生物藥品的迅速發展，研究人員將面臨的一項挑戰任務是開發一種可靠、耐用和高效的檢測方法，以在體外和體內檢測和量化有效的生物藥品成分。

最常用的方法包括經典配體結合測定(LBAS)、LC-MS的測定，以及新出現的LBA-LC-MS混合技術。LC-MS和LBA-LC-MS是一個技術先進的方法，但是操作復雜，周期長，通量低，成本高，不適合于快速篩選和早期開發研究大樣本量的實際需求。

對于LBAS而言，ELISA是最常用的用于定量目的的方法。雖然在技術上要求較低并且成本低，但它高度特異性的抗體對，但是新的重組肽或蛋白質通常是不容易拿到高質量的抗體對。篩選可用的抗體對是耗時和費力的，涉及昂貴的純化步驟，并且依賴于使用的動物。另外，抗體可能無法檢測所有重組蛋白質構建體變體。

另一種常見的LBA是傳統的Western印跡法，但是無法準確定量，操作繁瑣，不穩定，不符合生物藥品準確性，耐用性和穩定性的要求。

基于Wes建立生物藥品活性成分檢測方法

（體外穩定性實驗和體內藥物代謝動力學）

俄亥俄州立大學藥學院的科學家，基于ProteinSimple的Wes定量Western blot技術開發了一種新的，高效，高靈敏度的定量工具，以支持治療性重組蛋白的早期開發，避免上述限制。

An efficient and quantitative assay for epitope-tagged therapeutic protein development with a capillary western system，Bioanalysis，Published online:20 March 2019。

簡述：本研究使用的重組蛋白，分子量約為55kDa，N端6X-His-標記，C末端DYKDDDDK(FLAG)。抗體：生物素化的抗Flag抗體，鏈霉親和素-HRP。Wes單次可以檢測25個樣品，在從樣品處理開始到數據采集的6小時內（Wes操作及檢測時間約為3.5小時).

LLOQ為0.4nM(20ng/mL)。作者基于該平臺完成了一個方法開發快，高效的，檢測速度快的重組蛋白類藥物的體外穩定性研究和藥代動力學（PK）研究的技術平臺，且無需產生特異性單克隆抗體。該方法也消除了目標蛋白富集步驟，富集可能引入顯著的樣本間變異性。

Wes自動化的免疫測定平臺，基于毛細管電泳技術，整合了免疫學檢測方法。

在生物制藥領域具有一系列獨特優勢

1. 全程自動化

2. 精密度高

3. 耐用性好

4. 靈敏度高

5. 準確定量
 

部分結果

精密度

體外穩定性實驗

體內藥物代謝動力學（PK）實驗

作者文章總結
• Development and validation of a reliable, robust and efficient assay to detect and quantifymacromolecules in vitro and in vivo during the early stage of a biotherapeutic agent discovery remain a major challenge for researchers, especially in the academia setting where resources can be limited.
• A simple (enrichment-free), highly sensitive and efficient immunoassay using a capillary-based western system to assess the in vitro stability and pharmacokinetic properties of propitious epitope-tagged recombinant proteins in vivo in mouse to support an early stage development of a lead therapeutic recombinant protein.
• The method validation results demonstrated satisfactory characteristics in specificity, linearity, accuracy and precision.
• This protocol avoids the need of laborious and costly customized monoclonal antibody as is typically essential for an ELISA or multistep enrichment process which are often indispensable when employing a liquid chromatography–mass spectrometry-based method.
• The protocol is capable of quantifying up to 25 samples at the dynamic concentration range from 5 to 200 ng/ml with an LLOQ of the target protein at 0.4 nM (20 ng/ml).

方法學的優化，請閱讀文章原文