對(duì)于細(xì)胞：

注意：取適當(dāng)量的裂解液，放與4℃預(yù)冷，使用前數(shù)分鐘內(nèi)需加入酶抑制劑。

1.  貼壁細(xì)胞，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并收集5×106 個(gè)細(xì)胞，600g 離心5分鐘，盡量吸盡上清，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，600g 離心5分鐘收集細(xì)胞，盡量吸盡上清，加入0.5ml的預(yù)冷的裂解液，用移液器吹打數(shù)下，冰上孵育30分鐘, 10000g離心10分鐘，取上清，即為蛋白提取物。

注意：可以直接將裂解液加入培養(yǎng)細(xì)胞的器皿中裂解細(xì)胞，具體操作如下，

A.用移液槍小心吸去培養(yǎng)液，

B.加入適量的預(yù)冷的PBS,

C.用移液槍小心吸去PBS,

D.按照下表加入裂解液，冰上孵育30分鐘。

E.將裂解液轉(zhuǎn)入離心管中， 10000g離心10分鐘，取上清，即為蛋白提取物。

2.懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并收集5×106 個(gè)細(xì)胞，600g 離心5分鐘，盡量吸盡上清，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，600g 離心5分鐘收集細(xì)胞，盡量吸盡上清，加入0.5ml的預(yù)冷的裂解液，用移液器吹打數(shù)下，冰上孵育30分鐘, 10000g離心10分鐘，取上清，即為蛋白提取物。

對(duì)于組織：

注意：取適當(dāng)量的裂解液，放與4℃預(yù)冷，使用前數(shù)分鐘內(nèi)需加入酶抑制劑。

1. 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，洗凈組織血跡，用濾紙吸干組織表面液體，將組織切成幾個(gè)較小的組織塊。

2. 稱量組織，按組織凈重(g)：裂解液(ml)=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿 ，(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量)。

3. 勻漿器勻漿,肉眼觀察無(wú)明顯組織塊，冰上孵育30分鐘。

4. 10000g離心10分鐘,取上清，即為蛋白提取物。

結(jié)果實(shí)例：    

   M        N                M         N                 M         N     

          DSG3                     HSP90                      PCNA

M:Hela Cells  N：A549 Cells

如圖：增強(qiáng)型RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度，上樣20ug，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育博士德一抗，應(yīng)用博士德ECL發(fā)光液顯色。

故障排除: