一般我們把基因分成兩類：

• 編碼蛋白的基因
• 不編碼蛋白的基因

這兩類基因的敲除方式有著很大的區(qū)別

編碼蛋白的基因

這些基因的功能主要是通過編碼區(qū)中的三聯(lián)體密碼所編碼的蛋白來實現(xiàn)的。基因敲除的最終目的是讓這個基因的蛋白產物不能發(fā)揮功能，或者蛋白不能表達。

• 整個編碼區(qū)統(tǒng)統(tǒng)刪掉

所有的密碼都沒了，當然就不能翻譯出蛋白啦！對于目的基因的敲除來說，這當然是最徹底的一種方法，不過大多數(shù)情況下，這個方案很難實現(xiàn)。原因有下面幾個：

1）編碼區(qū)跨度大。雖然CRISPR技術能夠大片段地剪掉DNA序列，實現(xiàn)大跨度的全身性基因敲除；但對于條件性基因敲除來說，如果兩個loxP位點之間距離過大，仍會導致不僅構建模型的難度大、重組率低下，而且可能影響flox小鼠的最終使用效果，即Cre-loxP的重組效率。

2）可能有其它基因存在于內含子中，這樣的敲除相當于敲除了兩個甚至多個基因，最終小鼠的表型就會是多個基因共同缺失的結果了。

• 僅僅刪掉“一小部分”

1）刪掉一個或幾個外顯子，被刪掉的外顯子長度不是3的整數(shù)倍。這樣的話，三聯(lián)體密碼就會發(fā)生錯位，導致移碼突變或提前終止。可能會使蛋白不能被翻譯出來，也可能會產生一個突變的蛋白產物。這也是最為常見的基因敲除策略。通常，刪掉的外顯子越靠前，對功能蛋白的破壞就越徹底。所以，盡量要選擇靠前的外顯子作為基因的敲除區(qū)域。

2）刪掉編碼功能結構域的部分。這樣，即使沒能發(fā)生移碼，最終翻譯出來的也會是缺失功能域的一個次品，也可以達到使蛋白功能缺失的目的。

3）刪掉啟動子。如果1和2都不能作為敲除區(qū)域的話，可以考慮敲除啟動子區(qū)域使基因失活。

所以，基因敲除并不是非要把整個基因都刪掉，大多數(shù)情況我們只需要敲掉基因的一小部分，讓這個基因不能編碼正常的功能蛋白，也就達到了基因敲除的目的。

不編碼蛋白的基因

對于要敲除像lncRNA、microRNA這些不編碼蛋白的基因，最徹底的方法還是整個lncRNA區(qū)段或大部分片段序列的刪除。

但是，很多l(xiāng)ncRNA可能是與某個蛋白編碼基因反向重疊或部分反向重疊的，這時候敲掉整個lncRNA序列就不合適了，可以考慮以下幾種方式：

1）刪除一小部分功能區(qū)域，前提是已知這部分可能是特定的功能區(qū)。

2）刪除啟動子區(qū)域，如果lncRNA啟動子區(qū)域不跟其它基因重疊。

3）通過CRISPR技術插入RNA不穩(wěn)定信號（比如polyA信號、miRNA結合位點、RNase P識別位點、自剪切酶等）的方式，來進行l(wèi)ncRNA的敲低。

所以，針對這些不編碼蛋白的基因，考慮本身結構的特殊性，需要我們面對不同基因時選擇不同的敲除方式。