細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細胞周期反應(yīng)了細胞增殖速度。細胞周期是一個重要的檢測參數(shù)，研究細胞周期變化的影響對于腫瘤的發(fā)展及藥物研發(fā)有著重要的作用。例如，已知抑制有絲分裂的化合物大都用來減緩腫瘤細胞的生長。

細胞周期內(nèi)有兩個階段最為重要：G1 到 S 和 G2 到 M；這兩個階段正處在復(fù)雜活躍的分子水平變化的時期，容易受環(huán)境條件的影響，如果能夠人為地進行調(diào)控，將對深入了解生物的生長發(fā)育和控制腫瘤生長等有重要意義。能夠方便有效地檢測細胞周期的變化，對于藥物研發(fā)和疾病研究等都具有重要的意義。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

那么，細胞周期的測定如何進行的呢？測定細胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、流式細胞儀法、基于細胞成像的熒光檢測法等。

一、同位素標(biāo)記法測定細胞周期

標(biāo)記有絲分裂百分率法 (PLM) 是一種常用的測定細胞周期時間的方法。其原理是對測定細胞進行脈沖標(biāo)記、定時取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細胞，通過統(tǒng)計標(biāo)記有絲分裂細胞百分?jǐn)?shù)的辦法來測定細胞周期。

測定原理：

① 待測細胞經(jīng) 3H- 胸腺嘧啶核苷標(biāo)記后，所有 S 期細胞均被標(biāo)記。
② S 期細胞經(jīng) G2 期才進入 M 期，所以一段時間內(nèi) PLM = 0。
③ 開始出現(xiàn)標(biāo)記 M 期細胞時，表示處于 S 期最后階段的細胞，已渡過 G2 期，所以從 PLM = 0 到出現(xiàn) PLM 的時間間隔為 G2期的持續(xù)時間。
④ S 期細胞逐漸進入 M 期，PLM 上升，到達到最高點的時候說明來自處于 S 最后階段的細胞，已完成 M，進入 G1 期。所以從開始出現(xiàn) M 到 PLM 達到最高點 (≈ 100%) 的時間間隔就是 M 期的持續(xù)時間。
⑤ 當(dāng) PLM 開始下降時，表明處于 S 期最初階段的細胞也已進入 M 期，所以出現(xiàn) LM 到 PLM 又開始下降的一段時間等于 S 期的持續(xù)時間。

二、流式細胞儀 PI 染色法

細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些細胞在分裂結(jié)束后暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能 ( G0 期 )。

檢測細胞周期的原理：

由于細胞周期各時相的 DNA 含量不同，通常正常細胞的 G1 / G0 期具有二倍體細胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍體細胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結(jié)合，其熒光強度直接反映了細胞內(nèi) DNA含量。因此，通過流式細胞儀 PI 染色法對細胞內(nèi) DNA 含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區(qū)分為 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細胞百分率。

三、基于成像的熒光檢測法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鑒別細胞處在細胞周期的哪一時期，因此可以用來研究癌癥細胞周期的進程。FUCCI 技術(shù)建立在鑒定過表達的兩種調(diào)節(jié)細胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是綠色熒光基團 AmCyan，而 Cdt1 融合的是紅色熒光基團 mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平隨著細胞周期的變化而不斷波動：Cdt1 蛋白水平在 G1 階段達到峰值，而 geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不斷升高。這一結(jié)果體現(xiàn)為表達 FUCCI 細胞核在G1 期為紅色而在 S，G2 和 M 期則呈現(xiàn)綠色 ( 圖 2 )。

1 檢測方法

A375S FUCCI 球體準(zhǔn)備的方法如下：Corning 公司 96 孔 U 型底低吸附細胞培養(yǎng)板中加入含有 EGF (20 ng / mL) 和 B27 (1×)的 DMEM / F 12 培養(yǎng)基，按每孔 1,000 細胞進行種板。細胞板離心 (800 g,6 min) 后在 37 ℃，5% CO₂條件下進行孵育。最后，用含 10% FCS 的培養(yǎng)基清洗球體 3 次以移除 EGF 和 B27，繼續(xù)培養(yǎng) 1 至 6 天。

2 數(shù)據(jù)分析

MiniMax 細胞計數(shù)儀的透射光模塊可以從自動聚焦得到更好的圖像效果。SoftMax Pro 軟件中的“Field Analysis”能進行自定義分析從而鑒別細胞重疊的部分。我們應(yīng)用一種特殊的鑒別方法來區(qū)分目標(biāo)球體和其余物體，如殘渣和個體細胞，從而在后續(xù)的分析中予以去除 (Figure 2, A and E)。最后，我們選擇感興趣的區(qū)域并從圖像中去除不想要的物體。在綠色和紅色熒光通道中，球體可以通過“Object Count”模式中大小和與背景相對熒光強度的區(qū)別被輕易的篩選出來 (Figure 2, B-D, F-G)。然后運用SoftMax Pro 軟件計算圖像的“% Area coverage”和球體的“Object Area” (μm²)。圖像的獲取和分析的設(shè)置方法見表 1。

3 結(jié)果

SoftMax Pro 軟件中獲取及分析的設(shè)置可以在綠色和紅色熒光通道的透射光下簡便快速地分辨每個孔中的單球體。SoftMax Pro軟件還可計算所有通道包含的面積占比和物體面積 (μm²) (圖 3，表 2)。在綠色和紅色熒光通道下可以獲得最好的結(jié)果。對于 FUCCI 球體來說，圖 3 中紅色部分展示的是光滑圓潤的球體而綠色部分則在細胞表面，說明球體內(nèi)部的細胞處在 G1 期而表面細胞即將進入 M 期。對應(yīng)軟件可以分辨球體大小和形狀 ( 球形參數(shù) ) 的各種變化，因此常用來研究多種處理，如抗癌藥物，對細胞增殖的影響 ( 圖4 )。MiniMax 中綠色和紅色熒光的光學(xué)成形功能可以將 3D 圖像轉(zhuǎn)換為 2D 投射球體圖。

四、高內(nèi)涵檢測法

方法

1. 準(zhǔn)備細胞懸液，40,000 細胞 / mL 的 Hela 細胞懸液與 30 顆粒 / 細胞濃度的 FUCCI 試劑混合，以 4,000 細胞 / 孔的濃度種在 96 孔板中，孔板置于 37 °C，5% CO2 的環(huán)境下貼壁 8 小時。
2. 不同濃度的有絲分裂抑制劑處理細胞，然后孔板放入 ImageXpress Micro 系統(tǒng)。
3. 每隔 2-3 小時系統(tǒng)自動拍攝一次圖片，使用 20 倍 Plan Apo 物鏡，同時獲取明場及兩個熒光通道 FITC 和 TRITC 的圖像。實驗持續(xù) 48 - 72 小時，細胞可完成 1 - 2 次分裂。
4. 分析延遲實驗圖像使用 MetaXpress^® 高內(nèi)涵成像與分析軟件的用戶自定義模塊。

Premo^® FUCCI 細胞周期指示劑結(jié)合配置環(huán)境控制的 ImageXpress Micro 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和 MetaXpress 高內(nèi)涵分析軟件，可實現(xiàn)高效的活細胞周期精確測量。高通量篩選技術(shù)可為科學(xué)家提供一個快速、自動的基于圖像定量分析細胞周期的方法，并能夠完整地記錄長時間內(nèi)的細胞周期變化。另外，MetaXpress 軟件能夠在明場圖像識別細胞，避免了染料對活細胞的毒性。同一標(biāo)準(zhǔn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的定量分析方法可評價多化合物在不同濃度對細胞周期影響的相關(guān)參數(shù)。