簡介
細胞凋亡是一種發生在多細胞生物體內的程序性細胞死亡過程！生化反應導致細胞形態和特征變化及細胞死亡。形態變化包括細胞收縮、核分裂、染色質凝縮、染色 DNA 分裂及 mRNA 衰減。細胞凋亡是一種高度調控的過程，通過內在途經對各種壓力源做出響應，包括饑餓、感染、缺氧和氧化應激反應等。線粒體損傷在細胞凋亡的啟動過程中發揮重要的作用。在外部通路中，外部信號介導了細胞凋亡的產生，包括腫瘤壞死因子受體家族介導信號。以上兩種途徑以及細胞死亡進行過程都通過激活 caspase 激酶來實現。細胞凋亡調控過程的破壞與包括癌癥在內的許多疾病相關。在這篇應用中，我們介紹一種利用自動細胞成像系統進行細胞凋亡檢測的方法。

實驗方法
將人宮頸癌細胞系 HeLa, 培養在 Greiner 公司黑邊底透的 96 孔多孔板中，每孔 5,000個細胞，37°C, 5% CO2 條件下過夜培養。第二天，分別用不同濃度的抗腫瘤化合物十字孢堿 (Staurosporine)、絲裂霉素 CMitomycin C) 和喜樹堿 (Camptothecin)處理這些細胞誘導凋亡。化合物的最高濃度分別為：10 μM 十字孢堿；200 μM 絲裂霉素 C；100 μM 喜樹堿。加藥處理 18 小時后，使用試劑盒 EarlyTox™ Caspase-3/

NucView 488 dye 和 Ethidium HomodimerIII 染料以終濃度 5μM 和 3μM 分別對細胞染色 30 分鐘, 之后用 Hoechst 33342以終濃度 6 μM 對細胞進行染色，同時將細胞放回 37°C, 5% CO2 培養箱中靜置 15
分鐘。

EarlyTox Caspase-3/7 NucView488 試劑盒

Caspase-3、caspase-7 是在細胞程序性死亡過程中被激活的蛋白酶。EarlyTox試劑盒中的 Caspase-3/7 NucView 488底物用來檢測完整細胞中 caspase-3/7 活性。底物由一種與 caspase-3/7 DEVD 識
序列結合的熒光 DNA 染料組成。最初沒有熒光，底物透過細胞膜進入細胞質中。在凋亡細胞中 caspase-3/7 將底物裂解，釋放出的高親和 DNA 染料與細胞核中的 DNA 結合，在 500 nm 激發光照射下在 530 nm 處發出明亮的綠色熒光，可以用來評價 caspase 激酶的激活水平。Hoechst 33342 核染料用來確定細胞總個數，Ethidium Homodimer 用來確定死細胞 ( 即外膜受損的細胞 ) 的個數。

使用自動細胞成像系統評價細胞凋亡

染色之后，使用 ImageXpress® Pico 自動細胞成像系統，在 10x 物鏡條件下對細胞進行成像。每個成像位置分別采集 DAPI,FITC 和 TexasRed 三個熒光通道，曝光時間分別為 20, 500, 和 50 ms。圖1 展示了對照細胞及實驗組細胞結果，其中實驗組的化合物濃度分別為 0.3 μM 十字孢堿、10 μM 絲裂霉素 C。Hoechst 染色為藍色，凋亡細胞核為綠色，死細胞核為紅色。使用 CellReporterXpress 軟件中的凋亡分析流程采集樣品圖像并進行分析，得到凋亡細胞數量和百分含量。同時，通過分析 Ethidium Homodimer 染色結果得到死細胞數量，通過分析 Hoechst 染色結果得到細胞總數的相關參數。根據實驗結果生成細胞凋亡、死亡的濃度效應曲線及相應的半最大效應濃度 (EC50) 值見圖2。值得注意的是激酶抑制劑十字孢堿 ( 一種已知的細胞凋亡誘導物 ) 的 EC50 值比通過不同的機制介導細胞調亡的絲裂霉素 C低 100 倍左右。

結論
EarlyTox 試劑盒是一種有效的工具，可用于疾病生物學研究、抗腫瘤藥物評價及細胞健康狀況監測等領域。本篇應用介紹了一種利用 ImageXpressPico 全自動成像系統和 CellReporterXpress 軟件對 Early-Tox 試劑盒染色的樣品進行凋亡細胞量化和評價的方法和流程。

參考文獻
1. Green, Douglas (2011). Means to anEnd: Apoptosis and other Cell DeathMechanisms. Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press.ISBN 978-0-87969- 888-1.

2. Alberts, Bruce; Johnson, Alexander;Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts,Keith; Walter, Peter (2008). MolecularBiology of the Cell. (5th ed.). Chapter
8. Apoptosis: Programmed Cell DeathEliminates Unwanted Cells. Garland Science.p. 1115. ISBN 978- 0-8153-4105-5.

3. Karam, Jose A. (2009). Apoptosis inCarcinogenesis and Chemotherapy. Netherlands:Springer. ISBN 978-1-4020-9597-9.

4. Verweij J1, Pinedo HM. Mitomycin C:mechanism of action, usefulnessandlimitations. Anticancer Drugs. 1990 Oct;1 (1):5-13.