產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

支原體染色檢測(cè)試劑盒(Mycoplasma Stain Assay Kit)是一種經(jīng)典的利用DNA熒光染色法檢測(cè)支原體污染的試劑盒，其原理是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮，Hoechst33258染色后在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白。  

產(chǎn)品組成：

自備材料： 

1、 可觀察藍(lán)光的熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡

2、 PBS或生理鹽水

3、 載玻片、蓋玻片 

4、 預(yù)冷固定液：預(yù)冷的70%乙醇或4%多聚甲醛

使用說(shuō)明：

1． 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

a. 對(duì)于貼壁細(xì)胞，在六孔板或其它多孔板內(nèi)或蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞至50%-80%滿。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)滿會(huì)導(dǎo)致很難判斷是否存在支原體污染。

b. 對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞，取少量細(xì)胞做細(xì)胞涂片，空氣中充分晾干。

2． 用PBS按照1:10稀釋Hoechst染色液(1體積Hoechst染色液加入9體積PBS)。

稀釋后的Hoechst染色液宜在24小時(shí)內(nèi)使用。

3． 加適量固定液固定10-20分鐘。

對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，加入1ml固定液。確保固定液充分覆蓋樣品，固定前切勿對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌。另外對(duì)于貼壁細(xì)胞，固定前需去除培養(yǎng)液。

4． 去除固定液，空氣中晾干。

5． 加適量10倍稀釋的Hoechst染色液室溫染色10-30分鐘。

對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，加入1ml染色液。確保染色液充分覆蓋樣品，染色時(shí)注意避光。可以用鋁箔紙避光。

6． 去除染色液，空氣中晾干。

7． 滴加試劑盒中提供的抗熒光淬滅封片液，封片后熒光顯微鏡下觀察藍(lán)色熒光。

檢測(cè)效果對(duì)比圖：

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本試劑盒的檢測(cè)效果圖參考上圖。左圖為無(wú)支原體污染情況，中圖為支原體輕度污染情況，箭頭所指為微粒狀的一些支原體，右圖為支原體重度污染情況，可見(jiàn)大量微粒狀的支原體。

熒光顯微鏡觀察時(shí)需400倍或1000倍放大觀察(需使用油鏡)。參考上圖判斷支原體污染情況。沒(méi)有支原體污染或其它原核生物污染的細(xì)胞樣品，僅觀察到細(xì)胞核的藍(lán)色熒光，線粒體DNA不會(huì)被染色。有支原體污染的細(xì)胞樣品可以觀察到細(xì)胞核周圍微粒狀或絲狀藍(lán)色熒光。支原體污染嚴(yán)重的細(xì)胞可以觀察到大量微粒狀或絲狀藍(lán)色熒光。有細(xì)菌、酵母或霉菌污染的情況雖然Hoechst染色也會(huì)呈陽(yáng)性，但細(xì)菌、酵母或霉菌污染在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到，而支原體觀察不到，由此可以初步區(qū)分是支原體還是其它微生物。如有必要進(jìn)一步鑒定，可以通過(guò)把支原體接種培養(yǎng)和RT-PCR等方法進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。