抗體的概念

 動物機體受到抗原物質的刺激后, 由B淋巴細胞轉化為漿細胞產生的, 能與相應抗原發生特異性結合反應的免疫球蛋白, 這類免疫球蛋白稱為抗體(Antibody,簡稱 Ab)。

免疫球蛋白

免疫球蛋白(Immunogolobulin, 簡稱Ig)  是指存在于人和動物血液(血清)、組織液及其它外分泌液中的一類具有相似結構的球蛋白。

Ig根據單體數目、分子量、含糖量、電泳移動率等特點分為6類，主要是IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關的Ig主要為IgG和IgM。

Ig由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成，經二硫鍵連接呈Y型。Ig的輕鏈是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）兩種型別。

五類Ig的重鏈結構不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ

（gamma）鏈和μ（mu）鏈。

IgG的結構見圖。

IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區段，其中兩個相同的區段稱抗原結合片段（Fab）。每個Fab都保存結合抗原的能力，但只有一個抗原結合位點，是單價的，與抗原結合后不出現凝集或沉淀。另一區段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG特有的抗原性。

　　IgG可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F（ab'）2，能和兩個相同的抗原結合；另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無生物活性。

　　IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結合價，由于空間位置的影響，只表現為五個抗原結合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。

多克隆抗體(Polyclonal antibody，PAb):

抗原免疫動物所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物, 它是由抗原中多種抗原決定簇（即抗原表位）刺激多株B細胞增殖分化所產生的, 稱為多克隆抗體，也稱抗血清。

單克隆抗體(Monoclonal antibody, MAb) :

用雜交瘤技術獲得能分泌針對某一種抗原決定簇的特異性抗體的雜交瘤細胞系即單克隆抗體細胞系，由此單克隆細胞系產生的大量單一、同質的、高純度的針對單一抗原決定簇的特異性抗體，叫單克隆抗體。（由于每一個免疫淋巴細胞只能分泌針對單一抗原決定簇的特異性抗體）。

動物產生抗體的機理

抗原（非自己的物質）免疫動物

    →    激活免疫B細胞

        → 轉化成漿細胞

            →分泌針對免疫抗原的特異性的抗體

(一)抗原（Antigen, Ag）是指那些能誘導動物免疫系統發生免疫應答、產生抗體同時又能與免疫應答產物在體內外特異性結合、發生免疫反應的物質。

抗原的反應性取決于抗原決定簇（antigenic determinant），或稱為表位（epitope）。一個抗原分子可帶有不同的決定簇，在免疫測定中，抗原是指能與抗體結合的物質。能在機體中引起抗體產生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。

(二） 抗原的基本特性  

 抗原具有抗原性(antigenicity), 其包括免疫原性與反應原性兩方面的含義。

1、免疫原性(immunogenicity)

是指抗原能刺激機體的免疫系統，使之產生抗體的特性。

2.反應原性(reactinogenicity)

是指抗原與相應的抗體發生反應的特性, 此特性又稱為免疫反應性(immunoreactivity)。

抗原分為完全抗原及不完全抗原：

① 完全抗原   既具有免疫原性又有反應原性的物質稱為完全抗原(complete antigen)。如病毒、細菌、真菌等微生物和蛋白質等分子量大于5000Da生物物質；

② 不完全抗原  只具有反應原性而缺乏免疫原性的物質稱為不完全抗原(incomplete antigen), 亦稱為半抗原(hapten)。多糖、藥物、激素、肽類、抗生素、農藥等分子量小于5000 Da 物質半抗原需與BSA、OVA等載體蛋白交聯后成會完全抗原才能刺激動物產生相應的抗體；

半抗原-載體蛋白：

    半抗原單獨作用機體的免疫系統時無免疫原性，當與蛋白 載體（carrier)結合形成半抗原-載體復合物時，即可獲得免疫原性，這種復合物不但可刺激機體的免疫系統產生針對半抗原的抗體，也可以刺激機體產生針對蛋白質載體的抗體

構成抗原的條件：

一、異物性，又稱為異質性或異源性

正常情況下，自身組織或細胞對機體本身無免疫原性。而異種或異體物質，以及化學組成或結構發生改變的和由于某種因素而暴露的在胚胎期與免疫系統隔絕的自身物質則為良好的抗原。

二、理化性狀

大分子物質

 抗原的免疫原性與其分子大小有直接關系：

 1、免疫原性良好的物質分子量一般都在10000以上, 在一定條件下, 分子量越大, 免疫原性越強；

 2、分子量小于5000的物質免疫原性較弱；

 3、分子量小于1000的物質為半抗原, 沒有免疫原性。但與蛋白質載體結合后可獲得免疫原性；

抗原須為大分子物質的原因可能是：

 1、抗原分子質量越大，表面特殊化學基團（抗原決定簇）就越多，因而就越能有效地刺激免疫細胞，產生免疫應答。

 2、大分子抗原物質化學組成復雜、結構穩定，不易被破壞和清除，在體內停留時間較長，故可持續刺激免疫系統發生免疫應答。

一般來講, 分子量越小, 免疫原性越弱, 甚至失去免疫原性。因分子量越小的物質越傾向于誘導細胞免疫而缺乏誘導抗體形成的體液免疫的能力。

人工合成短肽鏈需與大分子載體連接才能激發機體的體液免疫和細胞免疫應答。

三、化學組成、分子結構

 大分子物質有時也并非一定是良好的免疫原，如分子量 99787的明膠，但因其分子結構和空間構象簡單，為直鏈氨基酸、易降解而使其免疫原性很弱。

一般來說,分子結構和空間構象愈復雜的物質免疫原性愈強。如含芳香族氨基酸的蛋白質比含非芳香族氨基酸的蛋白質免疫原性強。

多糖分子的免疫原性則主要取決于單糖的數目和類型，并且結構復雜者免疫原性強。

如果用理化方法改變抗原的空間構象, 其原有的免疫原性也隨之消失。同一分子不同的光學異構體之間也有免疫原性的差異。

 抗原分子并非所有的基團都作用一致, 決定其免疫活性的只是其中的一小部分抗原區域。

抗原決定簇(antigenic determinant)是指存在于抗原分子表面的能夠決定抗原特異性的特殊化學基團，是與抗體結合的位點。由于抗原決定簇通常位于抗原分子表面, 因而又稱為表位(epitope) 

 抗原決定簇是具有特殊立體構型和免疫活性的化學基團。

抗原決定簇決定著抗原的特異性, 即決定著抗原與抗體發生特異結合的能力。

抗原分子母體表面有不同的抗原決定簇，即具有不同的特異性, 而同一化學基團的不同異構體均可影響抗原的特異性。

功能性抗原決定簇和隱蔽的抗原決定簇

1、功能性抗原決定簇：

存在抗原分子表面，能被淋巴細胞識別，同時能與抗體特異性結合而發生免疫反應的抗原決定簇，稱為功能性決定簇。

2、隱蔽的抗原決定簇：隱藏在抗原分子內部的抗原決定簇

佐劑(Adjuvan)：   先于抗原或與抗原混合后同時注入動物體內，能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答，發揮輔助作用的一類物質。

佐劑作用：

保護抗原，延長其在體內的滯留時間，使抗原緩慢釋放；增強機體對該抗原的特異性免疫應答；增強免疫原性。

最常用的佐劑：

    弗氏佐劑（Freund’s adjuvant）是用礦物油（石臘油）、乳化劑（羊毛脂）和殺死的結核分枝桿菌(卡介苗)組成的油包水乳化佐劑，這三種成分俱全的佐劑稱為弗氏完全佐劑，不含結核分枝桿菌的佐劑為弗氏不完全佐劑。

的1、一只兔子每次的免疫劑量：

   細胞抗原不低于1x107 ；

   可溶性抗原100ug-1mg(300-800ug)；

   合成抗原為2mg（半抗原約為20-200ug）

 2、免疫途徑、免疫次數和間隔時間：

    選用皮內、皮下、肌肉、靜脈、腹腔或淋巴結內途徑進行免疫，一般完全抗原免疫3-4次，合成半抗原免疫6次以上，兩次免疫間隔時間一般為3周。

【一免】：抗原 300-500ul抗原（濃度為1ug/ul）+300-500ul福氏完全佐劑+適量青霉素和鏈霉素混合，充分乳化，兔子背腹部剪毛后皮下多點注射免疫；（免疫兩只兔子）

  注：抗原完全溶解后搖勻再取樣；福氏完全佐劑需搖勻后吸取免疫前取少量血清，作陰性對照

【二免】：間隔3周，300ul-500ul抗原+300ul-500ul福氏不完全佐劑+適量青霉素和鏈霉素混合，充分乳化，兔子背腹部剪毛后皮下多點注射免疫；

【三免】：間隔3周，300ul抗原+300ul生理鹽水+適量青霉素和鏈霉素混合，二側腿部肌注免疫;

【四免】：間隔14天，300ul抗原+300ul生理鹽水+適量青霉素和鏈霉素混合，二側腿部肌注免疫；

【五免】：間隔14天，300ul抗原+300ul生理鹽水+適量青霉素和鏈霉素混合，二側腿部肌注免疫；

注：

① 每次免疫后取少量血清，用瓊脂擴散試驗或間接ELISA測定效價，一般瓊脂擴散效價達1：32或間接ELISA測定效價達1：500000時可殺兔取血；

② 末免后7-10天取血放與平皿中，置37℃放30分鐘，4 ℃ 放置3-4小時，待血塊收縮后，吸血清到離心管，5000rpm離心5分鐘，上清即為血清，1.5毫升的離心管分裝-20 ℃ 保存。

淋巴細胞雜交瘤技術與單克隆抗體

    Köhler和Milstein在1975年建立了體外淋巴細胞雜交瘤技術，用人工的方法將產生特異性抗體的B細胞與骨髓瘤細胞融合，形成B細胞雜交瘤，這種雜交瘤細胞既具有骨髓瘤細胞無限繁殖的特性, 又具有B細胞分泌特異性抗體的能力, 由克隆化的B細胞雜交瘤所產生的抗體即為單克隆抗體

單克隆抗體制備原理

單克隆抗體雜交瘤技術基本流程

單克隆抗體的制備步驟

1、免疫原的制備；

2、免疫動物 ；選擇體重18-20g BALB/C 雌性小鼠用于免疫。50-100ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經背腹部皮下多點注射及腹腔注射相結合的方式免疫，總的免疫體積0.2-0.3ml每只；間隔3周，取與一免減半量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3ml每只；過2-3周后用加倍劑量的抗原進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行融合；

3、細胞融合 ；取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在無血清的RPMI-1640培養基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養基；用50% PEG（Sigma,分子量1500－4000）作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min；用無血清的RPMI-1640培養基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養基懸浮，分裝到96孔含有飼養細胞的細胞板中，37℃，5% CO2的細胞培養箱中培養。雜交瘤細胞的制備過程

4、雜交瘤細胞及陽性孔的篩選；細胞培養器皿中培養5天后，用HAT培養基換液一次，第10天用HT培養基換液，等到融合細胞覆蓋孔底10%-50%時，用常規間接ELISA方法篩選陽性孔，獲得對上述抗原有反應的陽性孔； 

5、陽性孔的特異性檢測及特異性陽性孔的克隆；陽性孔的特異性鑒定采用間接ELISA方法：用包被液稀釋成1-10ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4℃過夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10％的脫脂奶粉封閉30-60min;加入陽性孔培養上清100ul/孔，37℃ 1-2 小時；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小時，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/L H2SO4終止反應后，用酶標儀讀取OD492的值，以與陰性OD值比值大于2.1為陽性。獲對抗原有特異性反應的陽性孔。篩選出的特異性陽性孔用常規的有限稀釋法克隆，獲能分泌抗原特異性抗體的雜交瘤細胞株。細胞株進一步擴大培養，用于制備單抗腹水和液氮凍存；

6、雜交瘤細胞和一般細胞的凍存及復蘇方法；雜交瘤細胞通常用含有8％-10%的二甲亞砜和30％小牛血清的培養基凍存于液氮中，在液氮中細胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6個月短期保存。凍存細胞需要緩慢降溫（4℃冰箱放置15-30分鐘，-20℃冰箱放置30－60分鐘，-80℃超低溫冰箱中放置24小時），然后放置液氮中長期保存；也可用細胞程序凍存盒直接放置-80℃超低溫冰箱。復蘇細胞時需快速升溫，這樣可以確保細胞有較高的存活率。凍存細胞管直接放入37℃水中快速升溫復蘇，離心后去凍存液，沉淀的細胞用培養基懸浮后細胞培養箱培養；

7、單克隆抗體腹水制備及純化；取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷，7-10天后腹腔注入5-10×105個雜交瘤細胞，7-10天后可見小鼠腹部明顯膨大，取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。純化：取1倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸（30ul/ml腹水），室溫下邊加邊攪拌，4℃澄清1小時，12000rpm離心30min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小時，5000rpm離心5min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4℃PBS流動透析24小時后即獲純化的抗體，-70℃保存；

8、單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定；將單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C 小鼠IgA、IgG1、IgG2a、 IgG2b、IgG3、IgM抗體，作雙向瓊脂擴散試驗或雙抗夾心ELISA方法鑒定。用常規間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，腹水效價在10-5-10-7之間的可用于實際應用；

酶聯免疫吸附試驗技術（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）（定量、定性實驗）

ELISA是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques)的基礎上發展起來的一種免疫測定技術，既可以定性也可以定量。主要過程包括將已知抗原(抗體)吸附在固相載體即聚苯乙烯微量滴定板上稱為包被,然后用封閉液（5% BSA/PBS 溶液）將空余的位點占據，以避免后續抗體非特異性吸附。洗滌后加待測抗體(抗原), 再加相應酶標記抗體，形成已知抗原--待測抗體--酶標二抗的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。借助分光光度計的光吸收計算待測抗體(抗原)的量。

ELISA原理

（1） 抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學活性；

（2） 抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物,而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；

（3） 酶結合物與相應抗原或抗體結合后,可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在,而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示試驗結果；

常用ELISA方法

1、直接法：檢測抗原

     A:將待檢測抗原吸附在固相載體表面；

     B:加酶標抗體，形成抗原-抗體-酶復合物；

     C:加底物。底物的降解量＝抗原量。 

2、間接法 ：檢測抗體（本次ELISA方法）

     A: 將已知抗原吸附于固相載體表面；

     B: 加待檢測抗體，形成抗原抗體復合物；

     C: 加酶標二抗；

     D: 加底物。測定底物降解量=抗體量

3、雙抗體夾心法：檢測抗原

    A:將抗原免疫第一種動物獲得的抗體吸附于固相表面； 

    B:加待檢抗原，形成抗原-抗體復合物；

    C:加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復合物； 

    D:加酶標抗抗體(第二種動物抗體的抗體)；  

    E:加底物。底物的降解量＝抗原量。

4 競爭法：測定抗原

 A:將抗體吸附在固相載體表面；  

 B:對照孔只加入酶標抗原；

 C:樣品孔加入酶標抗原和待測抗原，競爭結合抗體； 

 D:加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

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