導言

成熟T細胞通過TCR識別并與抗原-MHC復合物反應。TCR活化的最直接后果是信號通路的起始，這些信號通路包括誘導特異性蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、PIP2分解、PKC活化以及細胞內鈣離子濃度的升高。這些早期事件被傳遞到核，產生諸多效應：

1、 T細胞克隆的擴增

2、 細胞表面活化標志的上調

3、 分化成效應性細胞

4、 誘導細胞毒或細胞因子的分泌

5、 誘導凋亡

最常用的體外刺激檢測 T細胞增殖的方法是用 TCR的抗原或競爭性抗體活化 T細胞。

本 protocol 是一個基本方法，用 CD3 體外刺激小鼠脾 T 細胞和人類外周血 T細胞的增殖，關鍵參數包括細胞密度、抗體滴度和活化動力學。

一、 小鼠：

用包被的 145-2C11單抗刺激小鼠T細胞；MTT法測細胞增殖

材料

1X 無菌 PBS

Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (Functional Grade, eBioscience Cat. No. 16-0031, or Purified,eBioscience Cat. No. 14-0031)

RPMI-1640 完全培養基

無菌的小鼠脾臟或淋巴結單細胞懸液

96 孔平底帶蓋微孔板

MTT Buffer

MTT裂解液

刀豆蛋白 A，可選 (ConA, Sigma Cat. No. C5275)

儀器用具

微量移液器或排槍

離心機

37°C, CO2培養箱

96孔板讀板機

實驗時間

2小時包被抗體

20分鐘制備脾臟單細胞懸液

20分鐘分析設置

2-4天孵育

實驗步驟

抗體包被至微孔板：

1、 用無菌 PBS 制備 5-10µg/ml 的 anti-CD3e (145-2C11)抗體溶液，計算所需的抗體量，每個條件或樣品做復孔。例如，包被半張板需要 2.6ml 抗體溶液。若用其他抗體共刺激時，CD3 抗體的濃度可以降低。

2、 每孔加入 50μl 抗體，空白對照孔加 50μl 無菌 PBS。

3、 用ParafilmTM膜將板封好，37℃孵育 2 小時或 4℃過夜。

4、 加細胞之前，將孔內的抗體溶液吸去。

5、 每孔用 200μl 無菌 PBS 洗后，棄去 PBS。

6、 重復洗一次，去除所有的未結合抗體。

加細胞：

1、 取脾臟，無菌制備單細胞懸液。溶血去除紅細胞。

2、 計數細胞并重懸于RPMI-1640 完全培養基中，濃度為 106/ml。根據實驗需要可選擇 2-3x106/ml～105/ml的濃度。

3、 洗板結束后，每孔加 200μl 細胞懸液，置于潮濕的 37°C, 5% CO2 培養箱中。可選擇加刺激對照：ConA 1-4µg/ml 刺激后孵育。

4、 孵育 2-4 天。可根據具體的實驗進行優化。

5、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培養箱中孵育 4 小時。

6、 每孔加 50μl MTT 裂解液，輕輕振蕩并孵育過夜。

7、 第二天 570nm 讀板。

8、 計算平均值和標準方差，作圖。

二、 人：

用 CD3 單抗刺激人外周血單個核細胞（PBMCs）；MTT 法檢測細胞增殖。

材料

1X 無菌 PBS

Anti-human CD3:

Clone OKT3 (Functional Grade， eBioscience Cat. No. 16-0037) or Clone HIT3a (Functional Grade， eBioscience Cat. No. 16-0039)

RPMI-1640 完全培養基

無菌 PBMC

96孔平底帶蓋微孔板

MTT Buffer

MTT 裂解液

儀器用具

微量移液器或排槍

離心機

37°C, CO2 培養箱

96 孔板讀板機

實驗時間

30 分鐘制備 PBMCs

20 分鐘設置分析

2-4 天孵育

實驗步驟

1、 制備PBMCs并重懸于RPMI完全培養基中，濃度 1-2x106/ml。可根據實驗調整細胞濃度至 2-3x106/ml～105/ml。

2、 每孔加 100μl 細胞懸液，每種樣品做復孔。

3、 每孔加 100μl 可溶性抗體，優化抗體濃度。若使用分離的 T 細胞做增殖分析，推薦用 10μg/ml 抗體包被在 96 孔板上進行刺激。

4、 放置于潮濕的 37°C, 5% CO2 培養箱中。

5、 孵育 2-4 天。可根據具體的實驗進行優化。

6、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培養箱中孵育 4 小時。

7、 每孔加 50μl MTT 裂解液，輕輕振蕩并孵育過夜。

8、 第二天 570nm 讀板。

9、 計算平均值和標準方差，作圖。

緩沖液和培養基

RPMI-1640 完全培養基：

900ml RPMI-1640

熱滅活的 100ml FBS（10%終濃度）

1ml 2-巰基乙醇

10ml L-谷氨酸鹽

抗生素混合物（可選）

MTT Buffer：

MTT 貯存液：溶于 1X PBS，濃度為 5mg/ml，避光保存

MTT 裂解液：

20% SDS 50% DMF

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