一、目的要求

利用濾膜法測(cè)定水中大腸菌群。

二、基本原理

濾膜法是采用過(guò)濾器過(guò)濾水樣，使其中的細(xì)菌截留在濾膜上，然后將濾膜放在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，大腸菌群可直接在膜上生長(zhǎng)，從而可直接計(jì)數(shù)。所用濾膜是一種多孔硝化纖維膜或乙酸纖維膜，用水系過(guò)濾膜即可，其孔徑約0.45μm。

三、試驗(yàn)原料及器材

實(shí)驗(yàn)原料：伊紅美藍(lán)瓊脂平板或遠(yuǎn)藤氏瓊脂平板，乳糖蛋白胨發(fā)酵管內(nèi)有倒置小套管），滅菌水，河水或湖水；

器材：鑷子；

夾鉗；

燒杯

真空泵（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；

濾膜（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；

過(guò)濾器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）等。

四、操作步驟

1．濾膜滅菌

　　 將濾膜放入裝有蒸餾水的燒杯中，加熱煮沸15分鐘，共煮沸三次，前兩次煮沸后換水洗滌2—3次再煮，以洗去濾膜上殘留的溶劑。

2．過(guò)濾器裝置

　　用無(wú)菌手續(xù)將已滅菌的過(guò)濾器基座、濾膜、漏斗和抽濾瓶安裝好，其中濾膜用滅菌鑷子（浸在95%酒精內(nèi)，用時(shí)通過(guò)火焰滅菌）移至過(guò)濾器的基座上。其他可直接用手或夾鉗操作，但不要碰到伸入抽濾瓶的橡皮塞部分，以免染菌。

3．將抽濾瓶接上真空泵。

4．加水樣過(guò)濾

　　直徑50mm的濾膜，所過(guò)濾的水量以培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落數(shù)一般需要較多過(guò)濾器裝置，多于50個(gè)為適宜，所以采用多聯(lián)過(guò)濾器最好，可以減少誤差。一般清潔的深井水或經(jīng)處理過(guò)的河水與湖水等可取樣 300—500 ml；對(duì)比較清潔的河水或湖水，可取樣1-100ml；嚴(yán)重污染的水樣可先進(jìn)行稀釋；未知的水樣可做三個(gè)稀釋度，選擇菌落數(shù)合適的稀釋度進(jìn)行計(jì)算。本次實(shí)驗(yàn)于過(guò)濾器漏斗內(nèi)加入比較清潔的河水或湖水100ml，加蓋。

5．開(kāi)動(dòng)真空泵進(jìn)行油濾。

6．抽完后，加入等量的滅菌水繼續(xù)抽濾，目的是沖洗漏斗壁。

7．濾畢，關(guān)上真空泵，用滅菌鑷子取濾膜邊緣，將沒(méi)有細(xì)菌的一面緊貼在遠(yuǎn)藤氏瓊脂平板或伊紅美藍(lán)瓊脂平板上。濾膜與培養(yǎng)基之間不得有氣泡。

8．將平板倒置于37℃下培養(yǎng)22—24小時(shí)。

9．挑取符合大腸菌群菌落特征的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

10．將鏡檢為革蘭氏陰性、無(wú)芽胞桿菌的菌落再接種一支乳糖蛋白胨發(fā)酵管，經(jīng)37℃培養(yǎng) 24小時(shí)，產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者即為大腸菌群陽(yáng)性。