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miRNA表達的定量分析是生物功能研究的基礎，細胞、組織或血液中的miRNA的檢測有助于發現新的早期診斷和預測療效及患者預后的生物標志物。我們提供優質的miRNA實時熒光定量PCR全套技術服務。
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miRNA熒光定量檢測服務
miRNA表達的定量分析是生物功能研究的基礎，是當今世界生物學研究的熱點領域。細胞、組織或血液中的miRNA表達譜的檢測有助于發現新的早期診斷和預測療效及患者預后的生物標志物。我們為您提供優質的miRNA實時熒光定量PCR全套技術服務。
一、miRNA qPCR技術服務項目：
1、 相對定量：以U6 snRNA或5S rRNA為內參，檢測樣本中相關miRNA的表達量。
2、 絕對定量：以化學合成的miRNA成熟鏈為標準品，做5個梯度點以上的稀釋后制作定量標準曲線，通過標準曲線對待檢測miRNA進行絕對定量。
3、 miRNA芯片數據確認：對芯片所篩選目的miRNA進行Real-time PCR數據驗證。
二、miRNA qPCR技術服務方法及儀器：
用SYBR Green 等多種常用熒光定量PCR試劑檢測表達情況；
檢測儀器為Bio-rad CFX96
三、miRNA qPCR技術服務流程：
1、 樣品RNA準備
提供樣品總RNA，也可提供組織、血液、細胞類樣品，需支付樣品的前期處理費用。
2、RNA質量檢測
紫外吸收測定法測定波長260nm和280nm的吸收值，判斷RNA樣品的濃度。
3、逆轉錄合成cDNA
利用莖凸環引物逆轉錄合成cDNA鏈。
4、實時熒光定量PCR
以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增（每個樣品檢測三次，同時檢測每個樣品中U6 snRNA或5S rRNA含量作為內參，以校正上樣誤差）。
5、分析結果、提供實驗報告
相對定量—分析相對表達參數，提供統計學分析，獲得相對表達差異；
絕對定量—依據miRNA標準品制作標準曲線（每條曲線上至少設置5個數據點），以定量樣品中的待檢測miRNA；
分析實時定量PCR結果，提供實時定量PCR實驗數據和擴增曲線，融解曲線，柱狀圖。
四、miRNA qPCR技術服務樣品提供：
a. RNA樣品：取10µg總RNA，并提供RNA質量檢測圖。要求濃度在500ng/µl以上，體積在20µl以上，OD260/OD280的比值在1.8至2.0之間，電泳檢測28s的亮度約為18s的兩倍。-80℃貯存，干冰運輸。
b. 組織樣品：請將200mg以上的組織樣本，并分裝為兩管。-80℃或者液氮貯存，干冰運輸。
c. 血液樣品：請提供至少2mL血樣，并在2小時內處理完畢后加入Trizol。
全血：用EDTA等抗凝劑處理后的樣本，按每200µl全血加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃箱保存，干冰運輸。
血漿：用EDTA等抗凝劑處理后的樣本，4℃ 4000rpm離心5分鐘，上層為血漿樣本，按每200µl血漿樣本加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰運輸。
血清：用非抗凝管收集血樣，靜置分離上層血清，按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰運輸。
d. 細胞樣品：
貼壁細胞
1、 貼壁細胞培養或處理結束后，去除培養液；
2、按每10 cm2 培養面積加1 mL Trizol試劑的比例加入Trizol試劑；搖勻，保證所有細胞接觸到Trizol而被充分消化；
3、用1 ml槍頭反復吹打, 并將Trizol細胞懸液轉移至RNAase-free 的EP管中；
4、 放入干冰或-80℃冰箱中保存，干冰運輸。
懸浮細胞
1、懸浮細胞培養或處理結束后，離心去除培養液；
2、保留的細胞用PBS 緩沖液快速洗一次，離心除去PBS 緩沖液；
3、按照每5×106 個細胞加1 mL Trizol的比例加入Trizol試劑，渦旋振蕩使細胞充分懸浮；
4、放入干冰或-80℃冰箱中保存，干冰運輸。
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