高通量篩選平臺助肽—人類白細胞抗原pHLA靶向藥物安全評估
高通量篩選平臺 ValidaTe 助力肽 - 人類白細胞抗原pHLA靶向藥物安全評估
--德國M2 點樣儀實現微腔芯片的高精準加樣
--德國M2 點樣儀實現微腔芯片的高精準加樣
T 細胞受體（T-cell receptor, TCR）療法、雙特異性 T 細胞銜接器（bispecific T-cell engagers, BiTE）等基于肽 - 人類白細胞抗原（peptide-human leukocyte antigen, pHLA）的免疫治療手段，已逐步在癌癥領域展現出巨大潛力，精準評估藥物與 pHLA 的結合特異性成為臨床前安全評估的關鍵。然而，僅HLA-I類分子的免疫肽組約至少15 萬種 pHLA 復合物，傳統技術如生物層干涉術（biolayer interferometry, BLI）、微陣列芯片SPR等，單次僅能最多檢測96種相互作用，通量低、耗時久，極大的脫靶風險。因此，開發超高通量的篩選方法，對于確保 pHLA 靶向治療藥物的安全性和有效性，具有重要的臨床意義。
2023 年 3 月，BioCopy 公司聯合 Immatics Biotechnologies公司在《Scientific Reports》發表題為《An ultra-high-throughput screen for the evaluation of peptide HLA-Binder interactions》的文章。在該研究中，構建了一種高通量篩選平臺ValidaTe，通過穩定化 pHLA 分子、聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxan, PDMS）微腔芯片與單色反射干涉技術（highSCORE）的結合，實現對 TCR 與超 500 種 pHLA 復合物相互作用的大規模篩選分析。
實驗方法如下：
實驗方法如下：
1.肽庫制備與微腔芯片預處理
- 肽合成：制備 127 種多肽（含野生型及單氨基酸突變體），經高效液相色譜HPLC純化后溶于二甲基亞砜（DMSO）/ 水（5%/95%），濃度 200 μg/ml。
- 微腔芯片（聚二甲基硅氧烷，PDMS 材質）：使用M2-Automation 非接觸式皮升級／納升級點樣儀iOne，將 300 pl 肽溶液精準點樣至 5k-PDMS 芯片的 5226 個微腔中（單個微腔體積 500 pL，直徑 150 μm，間距 50 μm）。（圖1）
- 干燥與存儲：室溫干燥后，芯片于 4℃保存，穩定期可達數月。
2.pHLA 復合物和肽-pHLA微腔芯片
- pHLA 純化制備：表達含二硫鍵穩定化修飾的人類白細胞抗原 A02:01（human leukocyte antigen A02:01, HLA-A*02:01）重鏈與 β2 微球蛋白（β2-microglobulin, β2m），體外復性后經生物素化修飾（BirA 酶標記），終濃度 200 μg/ml。
- 肽-pHLA-微腔芯片：通過M2-Automation 非接觸式皮升級／納升級點樣儀iOne，向含肽微腔中點樣 900 pl HLA 溶液。孵育后，pHLA 復合物通過生物素 - 鏈霉親和素（streptavidin, SA）相互作用，轉移至預活化的 3D 鏈霉親和素修飾玻璃片（highSCORE 芯片）。（圖1）
圖1肽-pHLA微腔芯片的實驗流程圖
（1）不同的多肽被點樣至微腔芯片的獨立微腔中，（2）多肽溶液干燥，（3）陣列可長期儲存（4）將生物素化的 HLA 分子點樣至各個微腔中發生復合物形成反應，（5）復合物通過生物素 - 鏈霉親和素相互作用轉移至鏈霉親和素（SA）修飾的基底上，（6）用于不同分析物的無標記分析，（7）結合曲線中確定動力學參數。
（1）不同的多肽被點樣至微腔芯片的獨立微腔中，（2）多肽溶液干燥，（3）陣列可長期儲存（4）將生物素化的 HLA 分子點樣至各個微腔中發生復合物形成反應，（5）復合物通過生物素 - 鏈霉親和素相互作用轉移至鏈霉親和素（SA）修飾的基底上，（6）用于不同分析物的無標記分析，（7）結合曲線中確定動力學參數。
3.超高通量結合動力學檢測
- 分析物制備：可溶性高親和力 TCR 分子梯度稀釋至 16-480 nM。
- highSCORE 檢測：將肽-pHLA 微腔芯片置于高通量反射干涉儀中，依次進行基線校正（180 s）、結合（250-500 s）、解離（300-600 s）檢測，流速 2 μL/s，單次運行生成 5226 條結合曲線。
- 數據擬合：采用 1:1 結合模型擬合動力學參數（結合速率常數kass、解離速率常數kdiss、平衡解離常數KD），6 次重復實驗累計獲得超 3 萬條有效曲線。
4.與傳統技術的對比驗證
- BLI 對照實驗：使用 Octet RED384 系統，檢測相同 pHLA-TCR 相互作用，對比發現 ValidaTe 平臺數據集通量提升650 倍，且KD值相關性良好（R2>0.85），驗證了新技術的準確性。(圖2)
圖2 a） 從 highSCORE 和 BLI 測量獲得的KD值之間的相關性；BLI WTKD值顯示為藍色虛線，highSCORE WTKD表示為綠色虛線，箭頭突出顯示突出的點，灰色的點被排除在線性擬合之外。（b） highSCORE（綠色）和 BLI（藍色）測量的log10(KD)值的直方圖；BLI WTKD值顯示為藍色虛線，highSCORE WTKD表示為綠色虛線。
研究結論:
1.技術突破：ValidaTe 平臺通過微腔芯片與自動化點樣技術（M2-Automation 非接觸式皮升級／納升級點樣儀iOne），解決了傳統微陣列中 pHLA 復合物穩定性差、材料消耗高的難題，單次實驗可處理超 500 種不同 pHLA 復合物，未來優化后有望突破 1000 種。
2.效率革命：相較于 BLI 的單次 96 通量得到的數據集，ValidaTe 實現650 倍提升，結合曲線生成速度從小時級縮短至分鐘級，大幅降低時間與材料成本（單 spot 材料消耗僅為傳統方法的 1/1000）。
3.應用價值：成功解析 TCR 與 pHLA 的結合特異性，定位關鍵氨基酸位點，為藥物設計提供精準靶點，推動臨床前脫靶風險評估進入 “全譜篩查” 時代。
技術前景與展望
該平臺已實現商業化服務（BioCopy），可定制化篩選多種 HLA 亞型及治療性分子（如 TCR 抗體、BiTE），適用于制藥企業、科研機構的早期藥物開發。未來計劃拓展至細胞水平檢測與復合物穩定性分析，助力更多創新型免疫療法安全落地。
更多信息請參考原文：https://www.nature.com/articles/s41598-023-32384-z
M2-automation位于德國，專注于提供納升-皮升級超微量點樣生物芯片應用領域的解決方案及服務。自公司成立即以來，20年始終致力于開發高精度高靈活性生物樣品噴點液體處理平臺，
M2系列產品采用接觸式/非接觸式點樣技術，可輕松實現包括但不限于納米柱、微陣列、微針等各種標準化和個性化生物芯片制備，廣泛應用于微流控、生物傳感器、臨床快檢（POCT）等領域。
環亞生物，生命科學產品全國性代理商，具備完善的公司運營、產品管理、營銷、售前技術支持和售后維修體系。環亞生物作為M2-automation大中華區代理商，負責相關產品大中華區的營銷和售后支持。
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環亞生物科技有限公司
地址：上海市松江區莘磚公路518號9幢502室
電話：021-54583565
郵箱：info@apgbio.com
網址：www.apgbio.com
1.技術突破：ValidaTe 平臺通過微腔芯片與自動化點樣技術（M2-Automation 非接觸式皮升級／納升級點樣儀iOne），解決了傳統微陣列中 pHLA 復合物穩定性差、材料消耗高的難題，單次實驗可處理超 500 種不同 pHLA 復合物，未來優化后有望突破 1000 種。
2.效率革命：相較于 BLI 的單次 96 通量得到的數據集，ValidaTe 實現650 倍提升，結合曲線生成速度從小時級縮短至分鐘級，大幅降低時間與材料成本（單 spot 材料消耗僅為傳統方法的 1/1000）。
3.應用價值：成功解析 TCR 與 pHLA 的結合特異性，定位關鍵氨基酸位點，為藥物設計提供精準靶點，推動臨床前脫靶風險評估進入 “全譜篩查” 時代。
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