引言
近期研究表明，偽魚腥藻(Pseudoanabaenasp.)普遍存在于南方的湖泊、水庫、河流和養殖池塘等水體，是銅綠微囊藻(Microcysisaeruginosa)以外又一常見的藍藻水華種，并已成為我國重要水體水華的絕對優勢種群，其細胞密度最高達到77.5%，在一些水庫中平均比例達22.75%。偽魚腥藻藻華使水體呈現灰紅色、產生異常嗅味的代謝物二甲基異次醇，分泌藻毒素導致動物肝臟毒性等一系列毒性效應，嚴重威脅水域生態環境穩定、養殖效益和人身健康，從而急需引起高度重視。

藻類生物量的監測是防控水華發生的最基本依據。葉綠素a熒光定量法用于檢測藻類生物量，具有檢測周期短、時效性強的優勢，但熒光定量法極易受藻團大小、藻種結構、環境因子條件變化影響，檢測結果可靠性和精確性成為葉綠素a定量檢測的瓶頸。可見分光光度法，通過吸光度直接建立一元線性回歸方程，即可測定藻密度或葉綠素a濃度。熒光光度法和可見分光光度法檢測葉綠素a的比較研究表明，當藻密度較低時，采用熒光分光光度法具有一定優勢，而當藻密度處在較高密度瀕臨水華狀態時，采用可見分光光度法表現出顯著優勢。近年關于可見分光光度法測定葉綠素a含量的研究和應用多局限于單一藻種，對包含多種藻類混合生物量的研究不多，僅見涂波等對6種微綠藻混合生物量的研究。采用可見分光光度法測定微藻不同門類混合藻液生物量的研究鮮見報道。應用可見分光光度法檢測重要水體中臨近水華狀態條件下高密度、多種類藻類藻密度及葉綠素a濃度無疑是重要水體水華防控經濟而有效的途徑。
已有的研究表明，采用可見分光光度法測定水體中的藻類密度時，形態不規則的藻類含量與光密度的相關性較差，而形態規則的近球形藻種，相關性較好。二形四鏈藻(Tetradesmusdimorphus)，常以4個近長橢圓形細胞組成群體形式存在;偽魚腥藻則常為不分枝絲狀，細胞圓柱形。在導致藻華的藻類中，偽魚腥藻最適生長溫度在25℃左右，綠藻柵藻通常在較低水溫下易占優勢，最適生長溫度為25℃。而部分藍藻(如微囊藻等)的最適生長溫度則高于25℃水溫，達到30～35℃，遠高于綠藻和偽魚腥藻。因此，二形四鏈藻作為富營養湖泊的綠藻門優勢種，常可與偽魚腥藻共存。該研究通過室內純種培養的偽魚腥藻和二形四鏈藻，研究其可見光光譜吸收特征，分析吸光度與單一及混合藻液細胞密度、葉綠素a濃度的相關性，探討重要水體水華發生的不同階段單一藻類生物量定量和自然水體多門類混合藻類生物量之間的相互關系，以期為進一步研發經濟有效的水華預警技術提供參考。

1.材料與方法
1.1藻種培養試驗藻種偽魚腥藻(Pseudoanabaenasp.)和二形四鏈藻(Tetradesmusdimorphus)購于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。采用BG－11培養基，接種后置于光照培養箱中培養，光照強度3500lx，光暗周期12h∶12h，溫度(25.0±0.5)℃。每日定時搖晃3次。培養至指數期，使藻密度達到106～107個/mL。

1.2藻種吸收光譜掃描偽魚腥藻和二形四鏈藻的吸光度使用紫外可見分光光度儀(UV－1100)測定，以蒸餾水調零，在400～800nm波長范圍內掃描，掃描間隔為5nm。

1.3純種藻密度的相關性分析二形四鏈藻以4.7×106個/mL、偽魚腥藻以5.7×107個/mL為初始濃度。用移液槍吸取一定藻液，用蒸餾水稀釋至10mL，以此配制成稀釋倍數為0、2 .5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0的濃度梯度，每梯度3個平行，用蒸餾水調零。用上述2種藻液共同對應的最大吸收波長測定溶液OD值，每個樣測定3次，取平均值。每梯度藻細胞的密度，顯微鏡下用血球計數板計數，制片計數3次，取平均值。以此結果進行稀釋倍數的倒數與吸光度、吸光度與藻密度之間的相關性分析。

1.4純種藻葉綠素a的相關性分析取指數期上述2種藻液，用蒸餾水稀釋0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0倍，配制成不同濃度梯度，每梯度3個平行，取一定量體積，用whatman玻璃纖維濾膜(��25mm)過濾，立即將濾膜對折于試管中，加入5mL95%的乙醇溶液，4℃冰箱中避光萃取24h，期間數次搖晃。將萃取后的上清液于恒溫離心機中以5000r/min離心10min，取上清液分別在波長665、649nm下測吸光度，葉綠素a濃度的計算根據李合生［20］的方法進行。同時對每梯度藻細胞進行計數，方法同“1.3”。以此結果進行葉綠素a濃度與藻密度之間的相關性分析。

1.5混合藻種藻密度與葉綠素a的相關性分析將“1.4”所配制的藻液濃度梯度，參考涂波等［13］的方法，各取一定體積1∶1等比例混合。在2種微藻共有的明顯吸收峰波長處分別測定各濃度梯度下的OD值、總細胞密度、葉綠素a濃度，以此來研究藻種藻密度與葉綠素a之間的關系。

2.結果與分析
2.1兩種微藻的光吸收曲線從圖1可以看出，偽魚腥藻在440、575和680nm處有較大的吸收峰;二形四鏈藻在440nm處有較弱的吸收峰，在685nm處有最大的吸收峰;2種微藻在680nm左右均有明顯的吸收峰。
2.2藻種稀釋梯度與吸光度的相關性為驗證不同吸收峰波長下吸光度是否與藻密度有線性關系，分別在不同波長下測定各藻液密度的吸光度。結果表明(表1)，2種藻液稀釋梯度(x)與其吸光度(y)之間均具有顯著線性相關(Ｒ2≥0.9996)，偽魚腥藻680nm的相關系數略高于440和575nm，二形四鏈藻在440、680、685nm的相關系數差異不顯著。將2種藻液按體積比1∶1混合后配制成不同濃度梯度，在共同吸收峰波長680nm時，其稀釋梯度與混合藻液的吸光度之間仍具有顯著線性相關(Ｒ2=0.9997)。
2.3藻種吸光度與藻密度的相關性分析吸光度和藻密度之間的相關性(表2)，2種微藻在各自吸收峰處，吸光度(x)和藻密度(y)均存在顯著的線性相關(Ｒ2≥0.9993)，這表明在試驗波長條件下藻液的吸光度能夠反映藻液的藻細胞密度;但藻液在680nm處的Ｒ2略高于440nm處;在680nm處，混合藻液的吸光度與總藻細胞密度之間也具有顯著的線性相關(Ｒ2=0.9998)，說明OD680可以相對準確地反映出試驗藻混合藻液的細胞密度。
2.4藻種葉綠素a濃度與藻密度的相關性將偽魚腥藻和二形四鏈藻葉綠素a濃度與其對應的藻密度進行相關性分析，結果表明(圖2)，2種藻液葉綠素a濃度與相應藻密度之間具有顯著的線性相關(Ｒ2≥0.9944)，其回歸方程分別為y=883.53x+77.43和y=372.83x+15.23，可據此方程，依據藻密度得到相應的葉綠素a濃度。將兩者1∶1混合后，總藻密度和葉綠素a濃度之間也存在顯著的線性相關(Ｒ2=0.9960，圖3)。因此，求得偽魚腥藻、二形四鏈藻及兩者混合后吸光度與葉綠素a之間的回歸方程分別為y=5.4750x、y=2.8288x、y=2.9673x，且方程相關系數Ｒ2≥0.9900，均有顯著的線性相關。這一結果表明可見分光光度法的OD680值可以相對準確地反映出試驗藻混合液的葉綠素a濃度。

3.討論與結論
3.1可見分光光度法測定混合藻液細胞密度波長的選擇波長的選擇是可見分光光度法測量過程中最關鍵的因素。以往的研究中，因藻種不同使用的波長存在較大差異，即便是同一藻種也不盡相同。例如，周利等研究偽魚腥藻的生長采用的是665nm可見光;而李麒龍等研究二形柵藻生長采用680nm。在對小球藻的研究過程中，學者們分別采用540、570和680nm的可見光。對一些綠藻吸收光譜的掃描研究結果表明，藻類吸收峰可分為3個區，其研究顯示，200～400nm紫外光區的吸收峰主要是藻體中的蛋白質引起;由于藻蛋白含量受藻生長時間的影響變化很大，因此一般不宜采用該波長對藻類生物量進行定量測量。而在＞400～ 600nm藍光區，葉綠素、類胡蘿卜素等色素則出現明顯的吸收峰，且各色素吸收峰相距較近，容易相互干擾或常表現交疊。因藻類都含有葉綠素a，所以其吸收光譜具有明顯的相似性，葉綠素a在670～680nm的紅光區吸收峰最為顯著。該研究結果也顯示，二形四鏈藻在藍光區域沒有明顯的吸收峰，但在680nm左右與偽魚腥藻一樣，均有一個明顯的吸收峰，這一結果與上述研究結論非常相近。此外，趙巧華等認為同一藻的標準化吸收光譜在不同生長時期基本恒定不變，色素組成及其比例的不同是引起藻類間吸收光譜變化的主要原因;涂波等對6株4屬綠藻的研究表明，形態上的巨大差異、不同生長時間、不同生理狀態并不影響它們在685nm處都具有最大吸收峰的特征，685nm處的OD值能準確反映微小綠藻生物量的變化;對于單一藻種，雖然在其他波長測定藻細胞密度也能獲得極顯著的線性相關，該研究結果也證實了這一點，但是為了便于種類間比較以及應用的普遍性，選用吸收峰680nm最為適宜。

3.2可見分光光度法測定混合藻液生物量的準確性可見分光光度法測定藻細胞密度多見于室內單種研究。在自然水體采集的藻類樣本，常常門類眾多，這使得研究單一藻種光吸收與藻細胞密度之間關系存在明顯的局限性。而采用可見分光光度法測定混合藻液細胞密度與光吸收之間關系的研究還很少見。涂波等用6株綠藻培養到20d，按等體積比例將6種藻液混合，設置不同梯度濃度，在685nm可見光測定OD值，分析其與混合藻液藻細胞密度之間關系，結果顯示，OD685與總細胞密度存在顯著的線性相關;這一研究結果表明，在685nm可見光下，藻液的OD值可以有效反映混合藻液的細胞密度，且精確度及穩定性均高于常規顯微計數。在該研究中，將二形四鏈藻與偽魚腥藻混合后，測定混合藻液在680nm處的OD值，發現其與總藻密度之間也存在顯著的線性相關。由此可見，可見分光光度法能夠有效反映吸光度與不同門類混合藻液細胞密度之間的線性相關。

在現有的文獻中，藻密度和葉綠素a之間的關系研究多僅限于純藻種之間，如銅綠微囊藻等。該研究結果顯示，單種或混合藻種在680nm處的吸光度與藻密度、藻密度與葉綠素a之間均具有顯著的線性相關性，證明可見分光光度法可用于藍藻偽魚腥藻與綠藻混合藻樣生物量的測定研究。這無疑為重要自然水體中特別在水華初期尚未形成絕對優勢種群時快速檢測浮游植物的生物量提供有效方法，從而為水華初級階段的有效預警提供了重要技術支撐。然而，并不是所有微藻的細胞密度與吸光度之間均呈顯著的線性相關，沈萍萍等選用綠藻門、金藻門、黃藻門、甲藻門在內的15種不同微藻，經回歸分析表明，形狀越規則的細胞，藻液的吸光度與細胞密度之間的線性相關性越好;而甲藻類細胞形狀多樣，且細胞體積較大，其相關性明顯較差。相關研究同時顯示，因藻細胞形態和在計數框線位置的原因，在鏡檢條件下進入觀察視野框線的藻細胞經常不被計入統計;因此，采用顯微計數制定藻密度標準曲線，在統計過程中會出現與真實數據間有顯著誤差的情況。這一研究結果提示，在使用可見分光光度法測定藻細胞生物量實踐中，要特別關注樣品中哪些藻種細胞形態與大小對測定結果的影響。

3.3可見分光光度法測定混合藻液生物量的應用展望近年來，有關碳生物量與吸光系數之間關系已經逐步開展。沈萍萍等通過藻體積計算出其碳生物量，并將碳生物量與吸光系數進行回歸分析，結果顯示，只要測得單一藻液或者混合藻液的吸光系數，就可以通過回歸方程求得它們的碳生物量，從而大大簡化浮游植物作為碳積累和排放重要載體過程中生物量的測定過程與方法。可見分光光度法測定浮游植物生物量，能夠同步測定藻密度、葉綠素a濃度和碳生物量及其相互轉換。此外，駱巧琦等通過幾種餌料藻種的室內試驗，研究表明基于可見分光光度法導數數學模型可不受藻類所處生長周期的影響;其算法簡單快速、精確度高，非常適宜微藻進入生長平臺期和衰退期的評估和判斷。結合該研究結果初步表明，可見分光光度法測定不同門類混合藻液樣品的生物量具有操作簡便、結果穩定準確的優點，為相關理論和方法的進一步研究提供了重要的應用價值依據。可見分光光度法儀器要求低、方法簡便和相對準確的優勢，對基層環保單位和養殖戶具有重要應用價值，但目前分光光度法應用于自然水體混合藻液生物量的研究僅限于個別報道，仍需要進一步深入研究。

文章來源：[1]曾祥波,李丁恒.可見分光光度法測定偽魚腥藻與二形四鏈藻混合藻液生物量[J/OL].安徽農業科學,1-4[2025-04-16].http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1076.S.20250228.1517.018.html.