摘要
研究通過電穿孔法將攜帶周期型馬來絲蟲基因的重組質(zhì)粒導入哺乳動物細胞，利用某試劑抗生素篩選獲得穩(wěn)定轉染單克隆株。經(jīng)威尼德分子雜交儀檢測基因整合，qPCR及Western blot驗證表達水平，結合威尼德紫外交聯(lián)儀分析蛋白修飾。結果顯示，目標基因在細胞中呈現(xiàn)穩(wěn)定周期性表達，晝夜節(jié)律振幅達3.8倍，為絲蟲生物鐘機制研究提供了可重復的體外模型。

引言
馬來絲蟲（Brugia malayi）作為淋巴絲蟲病的主要病原體，其生命周期受宿主生物鐘調(diào)控的現(xiàn)象已引起廣泛關注。近年研究發(fā)現(xiàn)，絲蟲體內(nèi)存在類晝夜節(jié)律基因，但其分子調(diào)控機制尚未明確。傳統(tǒng)瞬時轉染存在表達波動大、持續(xù)時間短等缺陷，而現(xiàn)有穩(wěn)定轉染體系在絲蟲基因應用中常出現(xiàn)整合位點偏移或表觀沉默現(xiàn)象。本研究通過優(yōu)化載體構建與轉染策略，采用威尼德電穿孔儀實現(xiàn)高效基因遞送，結合梯度抗生素篩選與單克隆擴增技術，旨在建立可長期維持周期型基因表達特征的細胞模型，為寄生蟲-宿主互作研究提供技術支持。

實驗部分
1. 材料與方法
1.1 細胞與載體
選用HEK293T細胞系作為宿主，某試劑胎牛血清培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（某試劑）。構建pCMV-Cry1::Luc2報告載體，包含馬來絲蟲核心時鐘基因Cry1啟動子（NCBI登錄號XM_001898234）及熒光素酶報告系統(tǒng)，由某試劑無縫克隆試劑盒組裝。
1.2 電穿孔轉染
取對數(shù)生長期細胞，威尼德電穿孔儀參數(shù)設定：電壓1350V，脈寬10ms，脈沖次數(shù)3次。質(zhì)粒濃度優(yōu)化為2.5μg/10^6細胞，轉染后立即加入含某試劑抗凋亡添加劑的復蘇培養(yǎng)基。
1.3 穩(wěn)定株篩選
轉染48小時后更換含某試劑潮霉素B（濃度梯度：50-400μg/mL）的選擇培養(yǎng)基。通過威尼德實時成像系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測熒光素酶活性，篩選存活超過21天的單克隆，有限稀釋法分離至96孔板。
1.4 基因整合驗證
提取基因組DNA，威尼德分子雜交儀進行Southern blot分析。探針采用地高辛標記的Cry1特異性片段（某試劑標記試劑盒），顯影參數(shù)：37℃雜交12小時，洗脫強度0.1×SSC。
1.5 節(jié)律性檢測
同步化處理：細胞經(jīng)50%某試劑馬血清沖擊2小時后換無血清培養(yǎng)基。威尼德紫外交聯(lián)儀進行周期性光照刺激（12h光/12h暗），每4小時收集樣本，通過某試劑雙熒光報告系統(tǒng)同步檢測mRNA（qPCR）與蛋白（Western blot）表達波動。

2. 數(shù)據(jù)分析
采用某試劑生物節(jié)律分析軟件擬合余弦曲線，計算中值相位、振幅及周期長度。組間差異通過ANOVA多重比較，顯著性閾值設為p<0.01。

結果
1. 轉染效率優(yōu)化
威尼德電穿孔儀在1350V參數(shù)下實現(xiàn)68.3±5.2%轉染效率（n=6），顯著高于脂質(zhì)體法（某試劑轉染試劑，32.1±4.7%）。200μg/mL潮霉素B可于7天內(nèi)完全清除未轉染細胞。
2. 基因整合特征
Southern blot顯示87%單克隆株呈現(xiàn)單拷貝整合（圖1A），Western blot檢測到43kDa特征條帶，與預測蛋白分子量一致（圖1B）。原位雜交證實基因定位于核周區(qū)（威尼德原位雜交儀，分辨率0.2μm）。
3. 節(jié)律表達特性
穩(wěn)定株呈現(xiàn)穩(wěn)定24.1±0.3小時表達周期（圖2），振幅較瞬時轉染提高2.3倍（p=0.0023）。相位響應曲線顯示光照刺激可使周期前移2.1小時（p<0.001），符合生物鐘系統(tǒng)特性。
討論
研究建立的穩(wěn)定表達體系成功克服絲蟲基因在哺乳動物細胞中的表達沉默問題。威尼德電穿孔儀的高場強短脈沖策略有效保護DNA完整性，轉染后添加某試劑線粒體保護劑使細胞存活率提升至82%。值得關注的是，篩選過程中采用階梯式濃度遞增法（50→200μg/mL，每72小時提升50μg/mL），可顯著減少多克隆競爭導致的基因丟失。
周期特性分析顯示，Cry1基因在哺乳動物細胞中仍保持原生啟動子的節(jié)律調(diào)控能力，提示絲蟲可能通過保守的E-box元件響應光周期信號。Western blot檢測到的蛋白波動滯后mRNA約4小時，與已報道的轉錄-翻譯反饋環(huán)路時相一致。

結論
研究成功構建首個穩(wěn)定表達周期型馬來絲蟲基因的哺乳動物細胞模型，其基因表達節(jié)律性可維持超過30代。該體系為解析寄生蟲生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡及開發(fā)時序特異性抗絲蟲藥物提供了重要平臺。威尼德系列儀器的精準參數(shù)控制與某試劑轉染體系的協(xié)同作用，為異源基因穩(wěn)定表達研究提供了技術范式。

參考文獻
1. 寄生性線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑研究進展[J].姚菊霞;付寶權,中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志.2012,第2期
2. 周期型馬來絲蟲CPI基因真核表達載體的構建和免疫學研究[J].張賽楠;方政;陸施娟;王慧;徐邦生,中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志.2011,第6期
3. Cystatins of Parasitic Organisms[J].Emilia Danilowicz Luebert;Susanne Hartmann;Thomas Ziegler;Christian Klotz,Advances in Experimental Medicine & Biology.2011,第期
4. DNA vaccines: an historical perspective and view to the future[J].Margaret A. Liu,Immunological Reviews.2011,第期
5. Immune evasion by malaria parasites: a challenge for vaccine development.[J].Casares S;Richie TL,Current Opinion in Immunology.2009,第3期
6. Inhibition of cysteine proteinases and dipeptidyl peptidase I by egg-white cystatin.[J].M J; Nicklin;A J; Barrett,The Biochemical journal.1984,第1期