HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)與培養(yǎng)要點(diǎn)
HUVEC細(xì)胞系血管形成能力驗(yàn)證
1. 實(shí)驗(yàn)方法：
（1）將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞系進(jìn)行無(wú)血清饑餓處理16-24h。
（2）從冰箱中提前取出基質(zhì)膠放入4 ℃的冰箱中過(guò)夜解凍，移液管或槍頭需提前預(yù)冷，使用預(yù)冷的移液管或槍頭混合基質(zhì)膠至均勻狀態(tài)。
（3）稀釋基質(zhì)膠，使用培養(yǎng)液將基質(zhì)膠1：1混合均勻稀釋到10 mg/mL，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。將完全解凍的基質(zhì)膠放至在冰上，翻轉(zhuǎn)幾次以混合內(nèi)容物后，48孔板中每孔加入150-200 μL。
（4）將加入了基質(zhì)膠的48孔板轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱中，在平整狀態(tài)下孵育過(guò)夜，使基底膜形成凝膠并自流平，第二天使用前提前置于37 ℃使基質(zhì)膠固化。
（5）對(duì)饑餓處理后達(dá)到80%融合的HUVEC細(xì)胞進(jìn)行消化，離心，計(jì)數(shù)。
（6）將細(xì)胞重懸在各組別培養(yǎng)基中，使?jié)舛葹槊亢辽?~3E5個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。48孔板中每孔加入含待測(cè)樣本的200 μL細(xì)胞懸液（含4~6E4個(gè)細(xì)胞）。
（7）將孔板置于37 ℃，5%CO2，90%濕度條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并在不同時(shí)間點(diǎn)拍照觀察，一般3-12小時(shí)可見血管網(wǎng)絡(luò)形成，成管時(shí)間與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。
2. 成血管實(shí)驗(yàn)注意要點(diǎn)：
（1）基質(zhì)膠(貨號(hào)：GUOR-R002)非常容易形成凝膠狀態(tài)，在解凍過(guò)程中全程放在4 ℃，（可提前一天放置在4 ℃冰箱解凍預(yù)冷，準(zhǔn)備一個(gè)-20 ℃的冰盒，將基質(zhì)膠放置在冰盒上），在48孔板移液過(guò)程中全程在冰上操作。因此移液槍頭也需要提前放至4 ℃預(yù)冷，也可將需要預(yù)冷的材料放至-20 ℃急凍。
（2）在向孔板中鋪膠時(shí)，小心且垂直地將液體移入孔中，避免基質(zhì)膠液體中出現(xiàn)氣泡。如果出現(xiàn)氣泡，將孔板在4 ℃下以300×g離心10 min，確保離心機(jī)預(yù)冷至4 ℃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有耗材均需要提前放置在4 ℃冰箱中預(yù)冷。
（3）在37 ℃凝膠期間不要搖晃平板，因?yàn)檫@將導(dǎo)致凝膠表面不均勻。
（4）凝膠形成后先觀察凝膠的形成狀態(tài)，常會(huì)出現(xiàn)類似沙丘的隆起和溝壑，這時(shí)需要靜置更長(zhǎng)的時(shí)間，確保凝膠表面是平整均勻的狀態(tài)后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
（5）在接種細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活率要大于95%才可用于實(shí)驗(yàn)并得到一個(gè)準(zhǔn)確的結(jié)果。
（6）當(dāng)將細(xì)胞添加到孔中時(shí)，要確保細(xì)胞混合均勻，因?yàn)榧?xì)胞密度對(duì)管的形成有影響。在加入細(xì)胞時(shí)，不要接觸凝膠的表面，并緩慢地加入細(xì)胞懸液，以免損傷凝膠材料。
（7）在實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)小時(shí)，不要搖動(dòng)平板或?qū)⑵鋸募?xì)胞培養(yǎng)箱中取出。在顯微鏡下觀察平板時(shí)，不要在細(xì)胞培養(yǎng)箱外保存超過(guò)一兩分鐘。
（8）如需對(duì)成管進(jìn)行熒光染色，熒光孵育時(shí)注意孵育時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致細(xì)胞彌散。
1. 實(shí)驗(yàn)方法：
（1）將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞系進(jìn)行無(wú)血清饑餓處理16-24h。
（2）從冰箱中提前取出基質(zhì)膠放入4 ℃的冰箱中過(guò)夜解凍，移液管或槍頭需提前預(yù)冷，使用預(yù)冷的移液管或槍頭混合基質(zhì)膠至均勻狀態(tài)。
（3）稀釋基質(zhì)膠，使用培養(yǎng)液將基質(zhì)膠1：1混合均勻稀釋到10 mg/mL，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。將完全解凍的基質(zhì)膠放至在冰上，翻轉(zhuǎn)幾次以混合內(nèi)容物后，48孔板中每孔加入150-200 μL。
（4）將加入了基質(zhì)膠的48孔板轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱中，在平整狀態(tài)下孵育過(guò)夜，使基底膜形成凝膠并自流平，第二天使用前提前置于37 ℃使基質(zhì)膠固化。
（5）對(duì)饑餓處理后達(dá)到80%融合的HUVEC細(xì)胞進(jìn)行消化，離心，計(jì)數(shù)。
（6）將細(xì)胞重懸在各組別培養(yǎng)基中，使?jié)舛葹槊亢辽?~3E5個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。48孔板中每孔加入含待測(cè)樣本的200 μL細(xì)胞懸液（含4~6E4個(gè)細(xì)胞）。
（7）將孔板置于37 ℃，5%CO2，90%濕度條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并在不同時(shí)間點(diǎn)拍照觀察，一般3-12小時(shí)可見血管網(wǎng)絡(luò)形成，成管時(shí)間與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。
2. 成血管實(shí)驗(yàn)注意要點(diǎn)：
（1）基質(zhì)膠(貨號(hào)：GUOR-R002)非常容易形成凝膠狀態(tài)，在解凍過(guò)程中全程放在4 ℃，（可提前一天放置在4 ℃冰箱解凍預(yù)冷，準(zhǔn)備一個(gè)-20 ℃的冰盒，將基質(zhì)膠放置在冰盒上），在48孔板移液過(guò)程中全程在冰上操作。因此移液槍頭也需要提前放至4 ℃預(yù)冷，也可將需要預(yù)冷的材料放至-20 ℃急凍。
（2）在向孔板中鋪膠時(shí)，小心且垂直地將液體移入孔中，避免基質(zhì)膠液體中出現(xiàn)氣泡。如果出現(xiàn)氣泡，將孔板在4 ℃下以300×g離心10 min，確保離心機(jī)預(yù)冷至4 ℃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有耗材均需要提前放置在4 ℃冰箱中預(yù)冷。
（3）在37 ℃凝膠期間不要搖晃平板，因?yàn)檫@將導(dǎo)致凝膠表面不均勻。
（4）凝膠形成后先觀察凝膠的形成狀態(tài)，常會(huì)出現(xiàn)類似沙丘的隆起和溝壑，這時(shí)需要靜置更長(zhǎng)的時(shí)間，確保凝膠表面是平整均勻的狀態(tài)后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
（5）在接種細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活率要大于95%才可用于實(shí)驗(yàn)并得到一個(gè)準(zhǔn)確的結(jié)果。
（6）當(dāng)將細(xì)胞添加到孔中時(shí)，要確保細(xì)胞混合均勻，因?yàn)榧?xì)胞密度對(duì)管的形成有影響。在加入細(xì)胞時(shí)，不要接觸凝膠的表面，并緩慢地加入細(xì)胞懸液，以免損傷凝膠材料。
（7）在實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)小時(shí)，不要搖動(dòng)平板或?qū)⑵鋸募?xì)胞培養(yǎng)箱中取出。在顯微鏡下觀察平板時(shí)，不要在細(xì)胞培養(yǎng)箱外保存超過(guò)一兩分鐘。
（8）如需對(duì)成管進(jìn)行熒光染色，熒光孵育時(shí)注意孵育時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致細(xì)胞彌散。
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