aBIOTECH：用于水稻核心啟動子編輯的CRISPR/FrCas9系統的開發

瀏覽次數：1314　發布日期：2024-5-31　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

近年來，CRISPR/Cas9技術在作物研究中取得了重要進展。然而，由于農業重要性狀大多是定量性狀，因此編輯啟動子以調控基因表達強度變得十分重要。真核生物啟動子由核心啟動子區域和上游順式調控元件（CREs）組成。通過靶向多個CREs來實現基因表達的改變通常是耗時的。相反，核心啟動子區域中的突變卻可以引起下游基因轉錄本的豐度顯著變化。然而，但受限于序列特征，常用的CRISPR系統通常難以用于核心啟動子編輯。最近發現的FrCas9與TATA PAM兼容，特別是與核心啟動子TATA盒序列兼容。然而，FrCas9的活性及其在植物中的編輯模式尚未確定。

近期，安徽省農業科學院水稻研究所李娟與安徽農業大學魏鵬程團隊在aBIOTECH發表了題為“Developing a CRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice”的研究論文。研究團隊設計了一種獨特的FrCas9系統，并利用該系統在水稻中進行基因編輯，展示了其編輯植物核心啟動子區域的潛力。

為了驗證FrCas9系統的核心啟動子編輯能力，作者使用TATA盒序列作為PAM，在Nipp（Oryza sativa L.cv Nipponbare）對白葉枯病菌（Xoo）易感基因OsSWEET13的近端啟動子上設計sgRNA。此外，為了直接監測編輯活性，設計了一個sgRNA以靶向水稻PDS基因。在48個PDS轉基因植株中，獲得了六個白化植株，表明FrCas9系統在水稻中具有活性。

為了評估FrCas9系統編輯TA豐富序列時的潛力以及在水稻中的編輯表現，作者在水稻PDS基因位點上設計了16個包含所有可能的5'-NNTA-3' PAM的sgRNA，通過對穩定轉化水稻愈傷組織的高通量測序表明，FrCas9系統編輯效率范圍從1.1%到35.3%，表明FrCas9的高PAM兼容性。FrCas9系統在TGTA、TATA和AGTA PAM位點編輯效率較高，分別達到35.3%、33.8%和32.1%，這與NNTA PAM的第二個核苷酸偏好為R（A/G）的假設一致。

為了進一步測試FrCas9的核心啟動子編輯能力，作者設計了一個帶有TGTA PAM的sgRNA，靶向水稻Waxy（WX）基因啟動子中非典型TATA（TACAAAT）序列。利用FrCas9編輯獲得了WX^iA和WX^iT純合編輯植株，純合/雙等位突變效率為50%。突變植株中WX表達量顯著下調，導致了直鏈淀粉含量（AC）顯著下降。同時，作者使用TATA為PAM的兩個相向靶點，實現了FrCas9介導的雙向編輯，在核心啟動子區產生多重突變和小片段精確缺失。此外，構建了源自FrCas9的堿基編輯器A3A-FrBE3和FrABE8e，并在T0轉基因植株中的評估其性能，結果顯示其具有較高編輯高精度。

CRISPR/FrCas9系統介導水稻基因組編輯

該研究在植物中建立了FrCas9介導的基因敲除和堿基編輯系統，并實現功能基因核心啟動子的高效編輯，為基因表達的微調和新種質的創制提供了技術支撐。

—— 原文 ——

Wang H, Ding J, Zhu J, et al, et al. Developing a CRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice[J]. aBIOTECH, 2024: 1-7.

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