百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，2019年4月Nature communications雜志上發(fā)表了一篇關(guān)于慢性腎病早期診斷標(biāo)志物篩選的文章《Identification of serum metabolites associating with chronic kidney disease progression and anti-fibrotic effect of 5-methoxytryptophan》，小編帶大家來看看，文章是通過哪些層層關(guān)卡最終鎖定診斷標(biāo)志物并找到潛在治療靶點(diǎn)的。

研究背景
慢性腎病（CKD）會(huì)使得腎功能逐漸喪失，發(fā)展到終末期腎病時(shí)（即尿毒癥），就需要通過透析來維持生命，或者通過腎移植來解救生命。CKD的早期階段1-2階段幾乎沒有明顯跡象和癥狀，一般直到后期階段才被發(fā)現(xiàn)，且心血管疾病發(fā)病率和死亡率的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)隨著CKD的進(jìn)展而增加，所以對(duì)于CKD早期診斷和治療是很有必要的。

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，目前臨床主要基于eGFR和蛋白尿水平進(jìn)行腎損害評(píng)估，其用于CKD診斷的假陽(yáng)性還是比較高的，所以我們迫切需要更好的評(píng)估腎功能的標(biāo)志物，以提高CKD診斷的準(zhǔn)確性。這篇文章就主要通過最接近表型的代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行了CKD早期診斷標(biāo)志物的尋找。
 

圖1 技術(shù)路線圖

研究方法
非靶向代謝組學(xué)（UPLC-HDMS）
靶向代謝組（UPLC-MS/MS）
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

研究結(jié)果
非靶代謝組學(xué)篩選生物標(biāo)志物
百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，通過對(duì)703例血清和尿液樣本（1-5期CKD患者組和正常對(duì)照組）進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)到25109個(gè)peak，基于最小絕對(duì)收縮和選擇算子（LASSO）的變量選擇得到124個(gè)差異peak，通過匹配數(shù)據(jù)庫(kù)最終定性出98個(gè)代謝物。后續(xù)文中進(jìn)行了隨機(jī)森林分析，支持向量機(jī)分類，并將這98個(gè)代謝物與臨床17個(gè)臨床指標(biāo)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析篩選，最終發(fā)現(xiàn)5-甲氧基色氨酸（5-MTP）、CSA、乙酰肉堿、tiglylcarnitine和牛磺酸這五個(gè)物質(zhì)可以清楚的區(qū)分CKD的所有臨床階段（見圖2），健康對(duì)照與疾病組也顯示明顯的區(qū)分差異。
 

圖2  五種選擇的代謝物用于區(qū)分不同的CKD階段

5個(gè)代謝物的外部驗(yàn)證
由于是CKD早期診斷標(biāo)志物篩選，文章中選取了CKD1和CKD2兩組與健康對(duì)照組（每組n=30例）進(jìn)行了這5個(gè)潛在生物標(biāo)志物靶向代謝檢測(cè)，通過聚類分析、PCA分析、隨機(jī)森林和支持向量機(jī)等分析發(fā)現(xiàn)這5個(gè)物質(zhì)可以將健康對(duì)照組，CKD1和CKD2組完美的區(qū)分開來（見圖3），外部驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步證明這5個(gè)物質(zhì)可以作為潛在早期診斷標(biāo)志物。
 

圖3 外部驗(yàn)證結(jié)果展示

5個(gè)代謝物的縱向隊(duì)列驗(yàn)證
百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，文中進(jìn)一步開展了一項(xiàng)前瞻性CKD研究，對(duì)1248名合格參與者實(shí)施了6年跟蹤，發(fā)現(xiàn)31名參與者新發(fā)CKD，隨后對(duì)這31名參與者發(fā)病前后的血清樣本進(jìn)行了這5個(gè)物質(zhì)的靶向代謝檢測(cè)，通過分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)果與訓(xùn)練集結(jié)果一致，發(fā)病前后兩組樣本可以很好的區(qū)分開來，且這5個(gè)物質(zhì)敏感性特異性都在85%以上（見圖4），也具有較高的AUC值。縱向隊(duì)列結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這5個(gè)物質(zhì)是可以作為CKD早期診斷標(biāo)志物的。
 

圖4 發(fā)病前后代謝水平差異顯著

藥物治療層面驗(yàn)證
接下來，文章中又研究了依那普利，潑尼松和五苓散藥物治療114名CKD2患者前后這5個(gè)代謝物豐度變化。研究發(fā)現(xiàn)除牛磺酸外，其他四種潛在代謝物在患者接受依那普利治療后顯著恢復(fù)。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，潑尼松和五苓散治療組，除了tiglylcarnitine外，其他四種潛在的生物標(biāo)志物在患者接受治療后均有顯著恢復(fù)（圖5），通過藥效比較，五苓散對(duì)CKD早期患者的治療效果優(yōu)于依那普利和潑尼松。以上所有驗(yàn)證結(jié)果均表明5-甲氧基色氨酸（5-MTP）、CSA、乙酰肉堿、tiglylcarnitine和牛磺酸這五個(gè)物質(zhì)可以作為CKD早期診斷標(biāo)志物。
 

圖5 藥物治療前后代謝物顯著恢復(fù)

5-MTP的腎臟保護(hù)作用
在5個(gè)生物標(biāo)志物中，5-MTP已有文獻(xiàn)報(bào)道其具有保護(hù)血管損傷和抗炎作用，但這尚未在腎損傷動(dòng)物模型或腎小管上皮細(xì)胞中得到證實(shí)。文中就進(jìn)行了體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來研究5-MTP對(duì)腎臟的保護(hù)作用。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，研究發(fā)現(xiàn)，5-MTP處理的小鼠、HK-2和HMC細(xì)胞，炎癥和纖維化均有明顯改善，相應(yīng)的一些炎癥因子表達(dá)也受到抑制，細(xì)胞保護(hù)途徑表達(dá)恢復(fù)，這些實(shí)驗(yàn)證明了5-MTP在體外和體內(nèi)發(fā)揮強(qiáng)烈的抗炎和抗纖維化作用。
 

圖6  5-MTP具有抗炎和抗纖維化作用

TPH-1對(duì)腎臟疾病的保護(hù)作用
前面研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了5-MTP具有抗炎和抗纖維化作用，而TPH-1是從L-色氨酸合成5-MTP的關(guān)鍵酶，文章中提出了假設(shè)：TPH-1對(duì)內(nèi)源性5-MTP的上調(diào)從而對(duì)腎臟疾病發(fā)揮了有利的治療作用，那到底是不是這樣的呢？后續(xù)文章又進(jìn)行了TPH-1過表達(dá)和敲除等一系列體內(nèi)體外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TPH-1的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致5-MTP含量升高，炎癥和纖維化得到改善，敲除之后結(jié)果相反。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，這些結(jié)果確定了TPH-1是可以作為治療CKD的潛在治療靶點(diǎn)。
 

圖7 TPH-1通過調(diào)節(jié)5-MTP水平起到抗炎抗纖維化作用

結(jié)   論
百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，本研究通過非靶代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)結(jié)合細(xì)胞和小鼠模型的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，最終篩選到5個(gè)CKD早期診斷標(biāo)志物（5-甲氧基色氨酸（5-MTP）、CSA、乙酰肉堿、tiglylcarnitine和牛磺酸），并證明了5-MTP具有抗炎和抗纖維化作用，且進(jìn)一步說明了是通過合成5-MTP的關(guān)鍵酶TPH-1起的作用，最終找到TPH-1可以作為治療CKD的潛在治療靶點(diǎn)。

整篇文章思路清晰明了，還在擔(dān)心做了非靶代謝組學(xué)之后的數(shù)據(jù)該如何分析嗎？還在擔(dān)心后續(xù)如何進(jìn)一步數(shù)據(jù)挖掘和結(jié)果驗(yàn)證嗎？看看這篇文章，思路有木有清晰一些呢？