項目文章：多組學助力腸道菌群在急性髓系白血病中的作用機制研究
急性髓性白血病（AML）是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征是未成熟的髓系細胞過度增殖。雖然化療已被證明對這種惡性腫瘤有效，但患者的長期生存率較低，且容易復發(fā)。AML患者的長期生存和預后與AML進展的多種因素密切相關，包括遺傳和穩(wěn)態(tài)環(huán)境變化。越來越多的證據(jù)表明，人類腸道菌群可以影響穩(wěn)態(tài)環(huán)境，并與炎癥、自身免疫性疾病，甚至癌癥的發(fā)展有關，但其在AML進展中的作用仍不清楚。
2022年5月，山東大學齊魯醫(yī)院馬道新教授課題組在Nature Communications（IF 17.694）上在線發(fā)表了題為“Gut microbiota regulates acute myeloid leukaemia via alteration of intestinal barrier function mediated by butyrate”的文章。該文主要利用16S rRNA測序和代謝組學技術，并結合體內(nèi)體外實驗揭示了腸道菌群以代謝物依賴的方式促進AML進展，為AML的靶向治療提供了新的思路和方法。中科新生命參與了該研究中非靶向代謝組和短鏈脂肪酸靶向代謝組的相關工作。
研究材料
AML患者和健康對照組、小鼠模型、細胞
技術路線
步驟1：AML患者腸道菌群的多樣性和組成發(fā)生顯著改變；
步驟2：AML引起腸道菌群生態(tài)失調(diào)，從而加速了AML的進展；
步驟3：糞菌移植延緩AML的發(fā)展；
步驟4：AML患者腸道菌群代謝物發(fā)生了顯著的改變；
步驟5：丁酸鹽灌胃可延遲 AML 進展；
步驟6：丁酸鹽可逆轉AML小鼠腸道屏障損傷；
步驟7：腸道屏障的損傷加速血液脂多糖（LPS）升高，從而加速AML進展。
研究結果
1. AML患者腸道菌群的多樣性和組成發(fā)生顯著改變
首先對AML患者與健康對照組的糞便樣本進行測序分析，共鑒定出2461個OTUs，結果顯示AML患者腸道菌群的多樣性和組成發(fā)生顯著改變，如AML患者的糞便多樣性明顯低于健康對照組；與健康對照組相比，在門水平上，AML患者的厚壁菌門(Firmicutes)顯著減少，擬桿菌門(Bacteroidota)富集；屬水平上，AML 患者糞便中的龔桿菌屬（faecalibacterium）等顯著較少，且發(fā)現(xiàn)糞桿菌與外周白細胞水平呈顯著負相關等。表明腸道菌群的低多樣性和較低豐度的糞桿菌可能在AML的進展中起重要作用（圖1）。
圖1 AML患者腸道菌群的多樣性和組成發(fā)生顯著改變
2. AML引起腸道菌群生態(tài)失調(diào)，從而加速了AML的進展
為了闡明腸道菌群在 AML 中的作用，作者構建了 MLL-AF9 AML小鼠并對小鼠糞便進行測序分析。結果發(fā)現(xiàn)，與健康對照小鼠相比，AML小鼠的腸道菌群多樣性隨著疾病的進展而顯著降低。通過使用抗生素處理AML 小鼠和正常小鼠糞便懸浮液灌胃AML小鼠實驗，觀察了細胞浸潤、增值、脾臟重量和大小等信息，結果表明 AML會導致菌群失調(diào)，破壞腸道菌群的多樣性會加速 AML 的進展（圖2）
圖2 AML引起腸道菌群生態(tài)失調(diào)，從而加速了AML的進展
3. 糞菌移植延緩AML的發(fā)展
之前研究發(fā)現(xiàn)糞桿菌與良好的預后相關，可被認為是AML患者的有益菌。通過單一糞桿菌灌胃實驗和補充或不補充糞桿菌的糞菌移植（FMT）實驗觀察了小鼠白血病細胞、脾臟重量和大小等信息，結果表明與單獨補充糞桿菌相比，完整腸道微生物群的移植在抑制 AML 進展中發(fā)揮更大的作用，并且補充糞桿菌可降低 AML-FMT 小鼠的白血病負擔（圖3）。
圖3 FMT延緩AML的發(fā)展
4. AML患者腸道微生物代謝物發(fā)生了顯著的改變
作者進一步研究了腸道菌群參與AML進展的具體機制，采用非靶向代謝組學方法研究了AML疾病組和健康對照組糞便、血液和骨髓樣本的代謝譜，發(fā)現(xiàn)組間有明顯差異，其中糞便樣本里的丙酸和丁酸顯著不同。接著使用GC-MS方法對腸道短鏈脂肪酸（SCFAs）進行靶向代謝組學檢測，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，AML疾病組糞便中的丙酸和丁酸水平顯著降低，且糞桿菌與丁酸呈正相關。后續(xù)通過糞桿菌灌胃等實驗證實丁酸是糞桿菌的直接代謝產(chǎn)物。菌群功能分析發(fā)現(xiàn)兩組之間丁酸代謝的相對豐度存在明顯差異，表明丁酸鹽可能在AML進展中發(fā)揮重要作用（圖4）。
圖4 AML患者腸道微生物代謝物發(fā)生了深刻的改變
5. 丁酸鹽灌胃可延遲 AML 進展
通過小鼠灌胃實驗發(fā)現(xiàn)丁酸鹽可以延緩AML進展，比如丁酸鹽處理的 AML小鼠比對照 AML小鼠表現(xiàn)出更多的脾腫大、細胞浸潤和增殖緩解，延長了壽命。此外，與 AML患者的結果一致，丁酸鹽處理的 AML 小鼠血液中丁酸鹽的濃度沒有明顯的變化，表明丁酸不是通過直接接觸殺死白血病細胞，而是通過其他機制延緩AML的進展（圖5）。
圖5 丁酸鹽灌胃可延緩AML進展
6. 丁酸鹽可逆轉AML小鼠腸道屏障損傷
與對照組相比，AML小鼠對FITC-葡聚糖的腸通透性顯著增加，表明白血病誘導腸道損傷。而與對照 AML 小鼠相比，丁酸鹽處理的 AML 小鼠的腸道損傷顯著改善，與正常小鼠相比，F(xiàn)ITC-葡聚糖通透性僅輕度增加。在正常小鼠和丁酸鹽處理的 AML小鼠腸上皮細胞連接的完整性較好，而AML小鼠腸上皮細胞之間存在顯著較大的間隙。作者進一步探討了腸通透性改變的機制，結果發(fā)現(xiàn)在AML小鼠中，細胞-細胞連接保護蛋白ZO-1和claudin-1的表達下調(diào)，而細胞-細胞連接抑制蛋白claudin-2的表達在mRNA和蛋白質(zhì)水平上調(diào)，這些變化在丁酸鹽處理的AML小鼠中逆轉（圖6）。
圖6 丁酸鹽可逆轉AML小鼠腸道屏障損傷
7. 腸道屏障的損傷加速血液脂多糖（LPS）升高，從而加速AML進展
LPS是腸道菌群產(chǎn)生的主要有害物質(zhì)，腸道屏障是LPS進入血液的唯一途徑。實驗發(fā)現(xiàn)AML疾病組血漿中LPS濃度顯著高于健康對照組，通過小鼠灌胃和注射LPS、補充丁酸鹽等實驗證實了菌群來源的 LPS 濃度與腸道屏障功能呈負相關，腸道屏障受損導致血液中LPS濃度增加，而丁酸鹽處理和 Con-FMT 處理則逆轉了這種作用，且LPS 在小鼠體內(nèi)加速AML進展，表明調(diào)節(jié)LPS含量對AML治療有效。
圖7 腸道屏障的損傷加速血液LPS升高，從而加速AML進展
小結
AML導致腸道完整性受損、菌群多樣性紊亂以及菌群代謝物的變化。腸道屏障功能下降、腸道內(nèi)容物中丁酸鹽含量降低和血液LPS升高是AML的促癌因素，丁酸鹽通過影響腸道屏障調(diào)節(jié)外周血LPS濃度（圖8）。
