qPCR擴(kuò)增過(guò)程中影響Ct值的因素及解決辦法詳解

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導(dǎo)讀

Ct值是熒光定量PCR重要的結(jié)果呈現(xiàn)形式，它被用于計(jì)算基因表達(dá)量差異或者基因拷貝數(shù)。那么熒光定量的Ct值多大被認(rèn)為是合理？如何保證Ct值的有效范圍呢？

Ct值以及Ct值的作用：

Ct值概念：

也稱(chēng)循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold。其含義是：在PCR 循環(huán)過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

Ct值的作用：

1）Ct值的重現(xiàn)性，PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

注：模板為105k拷貝GAPDH，用GAPDH引物擴(kuò)增。96個(gè)孔重復(fù)結(jié)果的Ct平均值為19.1，變異系數(shù)（Cv）=0.002.

2）Ct值與起始模板的線(xiàn)性關(guān)系，由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量的方法。

注：樣本進(jìn)行10倍的倍比稀釋后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)得到的Ct值。

合理的Ct值范圍：

Ct值的范圍為15-35，Ct值小于15，認(rèn)為擴(kuò)增在基線(xiàn)期范圍內(nèi)，未達(dá)到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，也就是標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，擴(kuò)增效率為100%時(shí)，計(jì)算出基因單個(gè)拷貝數(shù)定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數(shù)小于1，可認(rèn)為無(wú)意義。

對(duì)于不同的基因Ct范圍，因起始模板量中基因拷貝數(shù)和擴(kuò)增效率不同，需做出該基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出基因的線(xiàn)性檢測(cè)范圍。

影響Ct值的因素及解決辦法：

由擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系：擴(kuò)增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個(gè)數(shù)，可以看出，在理想條件下，起始模板量和En（擴(kuò)增效率）會(huì)對(duì)Ct值產(chǎn)生影響。模板質(zhì)量或者擴(kuò)增效率的差異會(huì)造成Ct值偏大或過(guò)小。