單細胞+空間轉錄組+多重免疫熒光，揭示結直腸癌肝轉移的免疫動態變化
工欲善其事，必先利其器！先進的技術總是能助力科研工作者拿到更好的實驗結果！而10x Genomics單細胞+Visium空間轉錄組，再結合上Akoya的多重免疫熒光，更是強強聯手！這不，復旦大學高強團隊聯合中科院巴斯德研究所張曉明團隊，利用這些技術，深入解析了結直腸癌肝轉移的免疫動態變化，研究成果于2021年8月20日發表在Cancer Discovery （IF=39.40）雜志上，真是可喜可賀！接下來，小編將帶領大家一睹這篇大作的風采。
文章題目：Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level
發表期刊：Cancer Discovery
發表時間：2021年8月20日
發表單位：復旦大學，中科院巴斯德研究所
文章摘要
肝轉移（LM）是結直腸癌（CRC）死亡的主要原因，表現出高度的免疫微環境異質性和抑制性。 本研究使用10x Genomics單細胞 RNA-seq 和Visium空間轉錄組學對 97 個匹配的樣本進行了測序。 值得注意的是，轉移性微環境經歷了顯著的免疫抑制細胞空間重編程，如 MRC1+ CCL18 + M2 樣巨噬細胞。本研究進一步開發了 scMetabolism，這是一種用于量化單細胞代謝的計算方法，并觀察到這些巨噬細胞具有增強的代謝活性。有趣的是，新輔助化療（NAC）可以阻斷這種狀態并恢復反應性患者的抗腫瘤免疫平衡，而無反應性患者則惡化為更具抑制性的狀態。本研究描述了轉移的免疫進化，并揭示了腫瘤如何對新輔助化療做出反應。
材料與方法
本研究的樣本來自于復旦大學中山醫院收集的病理診斷為結直腸癌肝轉移（CRLM）的樣本。其中：
-
來自 20 名患者（n = 11，未治療；n = 5，PD/SD；n = 4，PR）的 89 個樣本進行了10x Genomics單細胞轉錄組測序。
-
來自 4 名患者（n = 2，未治療；n = 2, PR) 的8個樣本進行了10x Genomics Visium空間轉錄組測序。
-
另外，來自 27 名患者的104 個樣本進行了Akoya多重免疫熒光分析。(n = 18, 未治療; n = 9, NAC-PR)。
研究結果
1. 單細胞結合空間轉錄組數據精確量化結直腸癌肝轉移腫瘤免疫微環境多樣性
本研究通過10x Genomics單細胞技術共捕獲了 178,630 個 CD45+ 細胞，平均每個樣本包含2,007 個細胞，基因中位數為 178,630 個 基因。經過細胞聚類分析，本研究定義了主要的細胞類型。與之前的結腸癌 scRNA-seq 基本一致。研究人員從 CRLM 樣本中鑒定了髓細胞、CD8+ T 細胞、CD4+ T 細胞、NK 細胞和 B 細胞。值得注意的是，不同組織類型的 T 細胞比例明顯不同，這表明了免疫微環境的組織異質性。在CRC 和配對的LM 中，Treg 細胞約占所有 CD45+ 細胞比例的 10% ，而這些細胞在相鄰的正常組織中則很少。這表明腫瘤內免疫受到抑制，這之前歸因于肝轉移中免疫治療效果的降低。
同時，本文開展了10x Genomics Visium空間轉錄組研究，通過無監督聚類分析將樣品分為不同的區域，例如腫瘤和成纖維細胞區域。隨后將 scRNA-seq 和 ST 數據利用Seurat軟件進行整合，量化主要免疫亞群。該研究發現免疫微環境顯示出從原發部位到轉移部位的動態細胞和空間變化。在 新輔助化療（NAC） 治療后，免疫表型在有反應的患者中經歷了抗腫瘤重塑，但在無反應的患者中轉向更多的免疫抑制，其中免疫抑制細胞在轉移部位重新編程。
2. 通過多種技術手段驗證腫瘤免疫微環境特征
接下來本研究通過另外三個獨立的 CRLM 隊列來驗證上述發現。首先本研究利用Akoya多重免疫熒光技術定量分析同一醫院另外 27 名 CRLM 患者（n = 18，未治療；n = 9，NAC-PR）中所選樣本的免疫細胞亞群的空間分布。研究人員觀察到，在未治療的樣本中， CRC 和 LM 中 FOXP3+ Treg 細胞、MRC1+ CCL18+ 巨噬細胞和 SPP1+ 巨噬細胞的浸潤顯著增加，這與前面的 scRNA-seq 數據基本一致。其次，本研究利用 ssGSEA 對 CRLM 的大量微陣列數據集中的免疫細胞進行評分。由于缺乏鄰近組織數據，我們只能檢查原發性和轉移性腫瘤之間的細胞豐度。根據前面的 scRNA-seq 數據，在該驗證隊列中，MRC1+ CCL18+ 巨噬細胞、SPP1+ 巨噬細胞和中性粒細胞在轉移性腫瘤中均顯著更高。第三，本研究探討了癌癥基因組圖譜 (TCGA) CRC 隊列 中 scRNA-seq 定義的免疫細胞亞群的預后價值。MRC1+ CCL18+ 巨噬細胞和 SPP1+ 巨噬細胞在原發性腫瘤中的高評分均預測預后顯著較差。總而言之，本研究的 CRLM 單細胞和空間免疫景觀可以在獨立的隊列中得到驗證，表明本研究數據的穩定性。這些觀察結果還使我們假設特定的巨噬細胞亞群可能在 CRLM 的促腫瘤生態位形成中發揮重要作用。
重要性聲明
本研究繪制了結直腸癌肝轉移的單細胞和空間轉錄組圖譜，并在轉移部位發現了高度代謝激活的 MRC1+CCL18+M2 樣巨噬細胞。有效的新輔助化療可以減緩這種代謝激活，提高靶向轉移代謝途徑的可能性。
