線粒體疾病是線粒體基因組（mtDNA）發(fā)生基因突變所導(dǎo)致的一類遺傳疾病, 僅通過雌性種系傳播。通常，細(xì)胞中超過60%的線粒體DNA發(fā)生突變就會(huì)導(dǎo)致疾病，并且一個(gè)人的線粒體DNA突變越多，其疾病就越嚴(yán)重，線粒體疾病目前是不可治愈的。

▲圖源：網(wǎng)絡(luò)（侵刪）

目前核移植（NT），也稱為線粒體捐贈(zèng)，作為一種預(yù)防線粒體疾病從患病母親傳給其后代的戰(zhàn)略而受到了越來越多的關(guān)注。但由于核移植中含有少量細(xì)胞質(zhì)來源的mtDNA，介導(dǎo)受體中mtDNA異質(zhì)性改變且伴有擴(kuò)增，因此需要對mtDNA突變負(fù)荷進(jìn)行準(zhǔn)確定量，現(xiàn)用NGS測序方法局限性在于成本較高、耗時(shí)較長、數(shù)據(jù)處理復(fù)雜且信噪比較低。

Leber遺傳性視神經(jīng)病（LHON）最常見的母系遺傳性線粒體疾病，比利時(shí)根特大學(xué)生物系專家團(tuán)利用數(shù)字PCR(dPCR)平臺(tái)對LHON相關(guān)m.11778 G＞A突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，并和NGS方法進(jìn)行對比，探討數(shù)字PCR在mtDNA異質(zhì)性定量中的適用性。研究成果發(fā)表在知名期刊《Clinical Chemistry》上。

檢測樣本信息:

為了評(píng)估dPCR在異質(zhì)性評(píng)估中的適用性，共設(shè)置了3種類型的樣品：（i）具有很高突變負(fù)荷的患者樣品13個(gè)；（ii）由健康志愿者捐贈(zèng)的同質(zhì)野生型樣品3個(gè)；（iii）經(jīng)過NT處理的樣品，由于mtDNA殘留而攜帶低突變負(fù)荷，共6個(gè)樣本。

檢測方法：

通過處理，將樣品突變負(fù)荷范圍設(shè)置在50％至0.01％，進(jìn)行分析驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論:

☑  在dPCR和NGS結(jié)果上觀察到的突變率具有良好的一致性。

☑與NGS相比，dPCR具有更低的背景噪聲。使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，非患者樣本中的突變等位基因沒有陽性信號(hào)，符合預(yù)期。

☑  和dPCR結(jié)果相比，在NGS結(jié)果中幾乎所有異質(zhì)樣品的次要等位基因頻率都被高估，初步猜測NGS實(shí)驗(yàn)流程中可能引入了錯(cuò)誤序列，經(jīng)過PCR擴(kuò)增改變次要等位基因頻率。

☑  相較于NGS，數(shù)字PCR成本低、操作簡便、結(jié)果直觀、更適用于低頻突變檢測。

☑  數(shù)字PCR方法適合用于核移植后線粒體異質(zhì)性定量檢測。

▲naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測不同mtDNA樣本二維圖（FAM-突變型，VIC-野生型）

左上：高突變負(fù)荷患者樣本；右上：野生型樣本；左下：NT后異質(zhì)性樣本；右下：NTC

▲Bland-Altman PLOT評(píng)估naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測結(jié)果和NGS結(jié)果的一致性

最后，文章conclusion給出-數(shù)字PCR具有更多優(yōu)勢，適用于核移植后線粒體的異質(zhì)性評(píng)估：

▲ 圖片來源：原文第8頁

期刊介紹：

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司的naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在進(jìn)行核酸檢測時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢。該系統(tǒng)利用cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作為數(shù)字PCR過程的耗材。樣品通過毛細(xì)通道網(wǎng)格以30,000個(gè)微滴的形式進(jìn)入2D芯片中。3色熒光檢測儀器，整個(gè)流程只需要2.5小時(shí)，并可進(jìn)行數(shù)據(jù)的質(zhì)控和結(jié)果追溯分析，獲得的數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對拷貝數(shù)濃度。