實時熒光定量PCR技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。由于其精準度好、靈敏度高，在分子生物學研究和醫(yī)學研究等方面得到了廣泛的應用，尤其是在基因表達差異分析方面。基因表達差異分析一般是比較不同時空樣本或不同處理樣本（藥物處理，物理處理和化學處理等）之間特定基因的表達差異。

當檢測出某個基因的表達是上調(diào)或下調(diào)時，我們并不知道這種表達差異是源自于它本身表達量的變化，還是樣本量大小或者操作導致的RNA的損失等其他原因?qū)е卤磉_量的變化。為了減少實驗偏差并產(chǎn)生準確的表達水平，RT-qPCR往往需要考慮幾個變量（如操作誤差或RNA提取量、得率及變異等）進行歸一化處理。目前，RT-qPCR標準化最常用的方法是使用內(nèi)參基因進行均一化處理。

什么是內(nèi)參基因？

理想情況下，在所有發(fā)育階段和不同實驗處理的反應中，內(nèi)參基因在不同組織的所有樣本中應具有相對穩(wěn)定的表達水平。內(nèi)參基因通常是各種管家基因，例如ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。它們的表達水平受環(huán)境因素影響較小，并且可以在生物體幾乎全部組織及各個生長階段持續(xù)表達。在不同的組織中，管家基因mRNA的含量都很豐富。

內(nèi)參基因的作用

在基因表達差異分析中內(nèi)參基因可以用于校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣定量的結果才更為可信。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下不會發(fā)生表達改變的基因作內(nèi)參。
 

理想的內(nèi)參基因應該滿足以下條件：

1.不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA的擴增；

2.高度或中度表達，排除低表達；

3.穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織(如正常細胞和癌細胞)，而且其表達量是近似的，無顯著性差別；

4.表達水平與細胞周期及是否活化無關；

5.其穩(wěn)定的表達水平與目標基因相似；

6.不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響。
 

內(nèi)參基因的評估

然而，已有證據(jù)表明，一些用于控制實驗偏差的傳統(tǒng)內(nèi)參基因僅在特定條件下是相對恒定的表達水平。很明顯，內(nèi)參基因是具有一定的特異性，沒有通用的內(nèi)參基因可用于所有實驗的內(nèi)控，這也表明在進行RT-qPCR實驗之前，必須正確選擇內(nèi)參基因。那么在選擇內(nèi)參基因時，可以通過geNorm、BestKeeper、NormFinder、RefGenes 等工具來評估，這是保證結果可靠準確的前提。其次可對候選的內(nèi)參基因進行qPCR 實驗做進一步的篩選。首選在不同樣本中均穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，即比較各樣品中Cq平均值以及Cq值的標準偏差，選擇SD最小的基因作為實驗內(nèi)參。

現(xiàn)在對內(nèi)參基因的選擇有所了解了嗎？

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