如何避免IP檢測(cè)過(guò)程中的重鏈干擾與輕鏈干擾
免疫沉淀 (Immunoprecipitation，IP) 是利用抗原抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法�？贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與ProteinA/G偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。
在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)后的WB驗(yàn)證環(huán)節(jié)中，當(dāng)使用常規(guī)的 Anti-IgG (H+L) 酶標(biāo)二抗時(shí)，通常會(huì)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)免疫沉淀一抗變性后產(chǎn)生的重鏈（50kDa）和輕鏈（25kDa）兩條帶。如果檢測(cè)的目的蛋白分子量在此附近時(shí)，就會(huì)受到這兩條帶的干擾。
如何避免IP檢測(cè)過(guò)程中的重、輕鏈干擾，AmyJet可為您提供兩種方案：
方案一：選擇WB一抗時(shí)，選擇和IP用一抗不同的種屬，避免IP一抗的干擾
| IP捕獲抗體類型 | WB檢測(cè)時(shí)一抗類型 | WB檢測(cè)時(shí)二抗類型 | 備注說(shuō)明 |
| 小鼠單抗/多抗 | 兔多抗 | HRP-標(biāo)記抗兔IgG二抗 | 由于 IP 捕獲抗體與 WB 檢測(cè)一抗屬于不同種屬來(lái)源抗體，故WB 檢測(cè)時(shí)使用 HRP-標(biāo)記抗兔 IgG 二抗可以有效避免重鏈輕鏈信號(hào)的影響。 |
| 兔多抗 | 小鼠單抗 | HRP-標(biāo)記抗小鼠IgG二抗 | 由于IP捕獲抗體與WB檢測(cè)一抗屬于不同種屬來(lái)源抗體，故WB檢測(cè)時(shí)使用HRP-標(biāo)記抗小鼠IgG二抗可以有效避免重鏈輕鏈信號(hào)的影響。 |
| 小鼠多抗 |
| 貨號(hào) | 名稱 | 應(yīng)用類型 |
| AMJ-AB2003 | 山羊抗兔IgG二抗，HRP標(biāo)記 | WB，IHC，ELISA |
| AMJ-AB2002 | 山羊抗小鼠IgG二抗，HRP標(biāo)記 | WB，IHC，ELISA |
方案二：選擇只和重鏈或輕鏈反應(yīng)的二抗
如果目標(biāo)蛋白分子量小于30KD，為了避免抗體輕鏈的干擾，選擇重鏈特異性二抗；如果目標(biāo)蛋白分子量大于30KD，為了避免抗體重鏈的干擾，選擇輕鏈特異性二抗。
| 類型 | 貨號(hào) | 名稱 | 應(yīng)用類型 |
| 無(wú)重鏈干擾 | AMJ-AB2016 | IP™ 山羊抗小鼠IgG輕鏈二抗，HRP標(biāo)記 | WB，IP |
| AMJ-AB2017 | IP™ 小鼠抗兔IgG輕鏈二抗，HRP標(biāo)記 | WB，IP | |
| 無(wú)輕鏈干擾 | AMJ-AB2018 | IP™ 山羊抗小鼠IgG重鏈二抗，HRP標(biāo)記 | WB，IP |
| AMJ-AB2019 | IP™ 山羊抗兔IgG重鏈二抗，HRP標(biāo)記 | WB，IP |
IP實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題匯總：
| 結(jié)果 | 原因 | 解析 |
| 顯影信號(hào)整體很弱，熒光信號(hào)淬滅 | 顯影液失效 | 通過(guò)檢查顯影液清澈度初判，并通過(guò)立即更換新顯影液后再曝 |
| 底物失效 | 將PVDF膜重新TBST略洗幾次，重新加合格的底物 | |
| 二抗孵育過(guò)多 | 如果操作較快，會(huì)出現(xiàn)第1張膠片曝光后信號(hào)極強(qiáng)，而第2張起可能信號(hào)淬滅；如果操作稍慢點(diǎn)，甚至第1張膠片起信號(hào)基本淬滅，這種情況建議重做，降低二抗?jié)舛�、減少孵育時(shí)間 | |
| 條帶正確，但顯影過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱 | 上樣量過(guò)大 | 可減小上樣量、提高一抗稀釋度并縮短曝光時(shí)間 |
| 上樣量過(guò)小 | 可增加上樣量、降低一抗稀釋度并延長(zhǎng)曝光時(shí)間 | |
| 背景雜亂厚重，大片“黑區(qū)”，導(dǎo)致無(wú)法分析 | 一抗孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 或濃度過(guò)高 |
4℃封閉過(guò)夜，一抗孵育1 hr，并可適當(dāng)增加洗膜時(shí)間 |
| Input泳道無(wú)目的帶，而IP泳道有 | 目的蛋白豐度不高，無(wú)法直接 Western blot 檢出，而 IP 能進(jìn)行濃縮富集 | |
| Input泳道有目的帶，而IP泳道無(wú) | 該種一抗主要識(shí)別和結(jié)合靶蛋白內(nèi)部的線性表位、而非暴露在外表的的線性或空間表位，故IP制樣時(shí)無(wú)法有效捕獲住組織或細(xì)胞中的完整結(jié)構(gòu)靶蛋白 | |
| 該蛋白濃度極低，導(dǎo)致捕獲過(guò)程不僅未起到富集作用，反而因?yàn)橄礈觳僮�，使靶蛋白損失殆盡，最后幾乎無(wú)靶蛋白被洗脫下來(lái)；或lysis buffer過(guò)強(qiáng)；或選用了不正確的beads； 或一抗亞型為 IgM 或 IgA | ||
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