數字PCR法檢測基因突變和基因缺失

瀏覽次數：7010　發布日期：2019-8-20　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

Drop-off數字PCR檢測方法的最主要優勢是能夠能夠在一個反應中檢測到基因組序列范圍短的同源基因突變（包括核苷酸的缺失，插入和替換）。簡單來講，Drop-off實驗包括兩個針對相同擴增子的TaqMan 探針：與野生型序列互補而與突變位點不發生互補的Drop-off探針和與突變型和野生型基因都互補的Reference探針（如圖1A）。在野生型等位基因的存在下，Drop-off 探針和Reference探針都將與目標雜交，產生雙重陽性信號（如圖1B，藍色群）。相反，如果存在突變的等位基因，即使一個核苷酸的突變也會阻止Drop-off探針與之雜交，因此只有Reference探針對目標基因進行退火，從而得到一個陽性信號。（如圖1B，綠色群）。

圖1信息說明如下：

A. Drop-off和Reference探針及引物在目標基因上的示意圖（FP：上游引物，RP：下游引物）

B. 2D圖中顯示來自雙陽性野生型等位基因的熒光簇（天藍色：藍色和綠色）和單一的突變等位基因的熒光簇（綠色）和陰性微滴簇（黑色）。

C. 值得注意的是在微滴生成過程中，某些突變等位基因和野生型等位基因隨機分布在同一液滴中，所以同一個液滴會同時顯示野生型和突變型（天藍色：藍色和綠色）。野生型濃度可以直接由雙色通道中的陽性液滴的比例獲得(第三個顏色通道的陰陽性微滴數不影響濃度計算)。突變型濃度可以直接單陽性微滴的比例獲得(第三個顏色通道的陰陽性微滴數不影響濃度計算)，其中已經刨除了雙陽性液滴的數量。所以將雙陽性液滴計算為突變陰性微滴，突變頻率可能會被低估。

可以通過以下方式獲取Drop off計算方法：

www.stillatechnologies.com/technical-notes 或Whale,AS,et al.,Biomol Derect Quantif. 2016 27:10:15-23獲取Drop off計算方法的更多信息。

Drop-off檢測KRAS，NRAS和EGFR熱點突變

在臨床應用中，通常檢測一組有預測意義的遺傳標記物跟蹤治療效果。例如：在非小細胞肺癌中，EGFR第19外顯子的缺失使其對第一代酪氨酸激酶抑制劑具有敏感性。在結直腸癌中，KRAS和NRAS原癌基因突變是EGFR抗體耐藥的重要指標。使用Drop-off和Naica三色多重檢測系統，設計了三種包含內部質控對照（IC，Internal Control）的Drop-off數字PCR檢測方法，用于檢測最常見的KRAS 3號外顯子、NRAS 2號外顯子和EGFR 19號外顯子的基因突變情況（如圖2,3）。增加內部質控品（IC）可以評估由于樣本中的抑制劑，從而評估方法的穩定性。

圖2信息說明如下：

分別檢測7個和4個最常見的KRAS 12號外顯子和NRAS 3號外顯子突變，以及EGFR外顯子19缺失的Drop-off實驗可靠性。在25ul PCR反應體系中，以95%的置信度在連續稀釋范圍從5%到0.25%的突變DNA中可以檢測到最終濃度為1cp/ul的突變DNA。所有檢測均在104copis的野生型DNA 和400copies的內部質控（來源于ØX174噬菌體）中進行，每個稀釋梯度進行了3次重復。所顯示的置信區間是理論置信區間的均值，該置信區間是在95%置信區間上由取樣誤差和分區誤差組成。

圖3信息說明如下：

A：三重實驗中KRAS，NRAS和EGFR drop-off實驗2D圖。模板用的是商品化DNA（KRAS和NRAS）和來自冷凍腫瘤組織的DNA（EGFR）。WT：野生型。

B：散點圖顯示加入DNA內部質控品ØX174時，三色通道中的熒光信號。

由于已知在KRAS和NRAS突變熱區中存在多種突變，EGFR 19號外顯子中存在不同長度的缺失或者插入，Drop-off實驗設計實現了用最少種類的探針達到快速、經濟、有效地同時篩查多種具有臨床意義的基因突變。如果需要，通過Drop-off實驗確定某個樣本為突變體后，即可使用序列特異性探針進行檢測，從而確定DNA樣本中存在的確切突變位點。

應用亮點：

● Drop-off數字PCR檢測能夠同時檢測基因組熱點區域發生的多種突變

● Drop-off實驗實現了使用至少種類的探針，快速、經濟、有效地篩選多種遺傳變異

Naica^TM數字PCR系統可以實現加入內部質控品的同時，使用Drop-off檢測方法進行臨床應用中通常檢測的7種KRAS突變、4種NRAS突變和發生在EGFR19外顯子的缺失/插入。