熒光原位雜交（FISH）技術(shù)的應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)流程
分子診斷是診斷市場(chǎng)增長(zhǎng)最快的部分。螢光原位雜交和FISH分析包括700萬人口的5億美元的市場(chǎng)。。FISH市場(chǎng)預(yù)計(jì)為11％，較去年同期成長(zhǎng)為下一個(gè)五年。400至500萬人口的市場(chǎng)，在美國(guó)產(chǎn)生。FISH測(cè)試是用來識(shí)別生物標(biāo)記DNA / RNA的形式。它是用于遺傳作圖和基因表達(dá)分析公知的方法。這種技術(shù)使用熒光染料標(biāo)記的探針，并映射到一個(gè)染色體或幀內(nèi)核DNA，以產(chǎn)生在原位通過顯微鏡觀察熒光信號(hào)的核苷酸序列。它是如細(xì)胞離心涂片（細(xì)胞懸浮液），然后觸摸用制劑或福爾馬林固定的新鮮制劑進(jìn)行的，也可以使用石蠟包埋的（FFPE）組織中。它主要用于以下領(lǐng)域研究和臨床診斷:
•產(chǎn)前診斷
•癌癥診斷
•出生缺陷的分子細(xì)胞遺傳學(xué)和精神發(fā)育遲滯
•染色體異常
•臨床遺傳學(xué)
•神經(jīng)科學(xué)
•生殖醫(yī)學(xué)
•毒理學(xué)
•微生物生態(tài)學(xué)
•進(jìn)化生物學(xué)
•比較基因組學(xué)
•細(xì)胞基因組學(xué)
•區(qū)分良性和惡性腫瘤
這個(gè)市場(chǎng)的多數(shù)是試劑包括FDA批準(zhǔn)測(cè)試,伴隨診斷,研究?jī)H使用探測(cè)器,定制試劑探針和支持和供應(yīng)。有必要進(jìn)行雜交執(zhí)行這些勞動(dòng)密集型的測(cè)試設(shè)備。理解需要雜交過程設(shè)備要求必須清晰地定義。
必要的設(shè)備如下:
——酸度計(jì)
——天平
——攪拌盤
——微離心機(jī)
——冰箱
——冷凍
組織準(zhǔn)備要求:
——切片機(jī)
——水浴
——原位雜交箱
執(zhí)行FISH過程將需要下列設(shè)備和材料除了試劑:
——載玻片干燥機(jī)
——水浴
——原位雜交爐
——Coplin罐
——蓋玻片
——染色皿
——橡膠膠水(可選:取決于設(shè)備使用)
——熒光顯微鏡DAPI過濾器(藍(lán)色),FITC過濾器(綠色),德州紅色過濾器攝影的能力
FISH的過程——簡(jiǎn)化
樣品準(zhǔn)備——depariffinization、脫水、空氣干燥,預(yù)處理(95 C @ 30分鐘,Coplin Jar),蛋白酶治療(37°C 10 - 20分鐘,Coplin Jar),脫水,空氣干燥,馬克,適用FISH類探測(cè)器,
用水泥覆蓋玻璃
變性 - 5分鐘@ 75°C（45 - 50℃，中期擴(kuò)展+額外的步驟，以變性探針）雜交 - 37℃，16小時(shí) - 72小時(shí)
貼標(biāo)過程
直接標(biāo)記 - 標(biāo)簽結(jié)合到探針和它是較不敏感的
間接標(biāo)記 - 檢測(cè)之前附加步驟，用抗體，結(jié)果放大單檢測(cè)探頭
存儲(chǔ) - 4 - 8°C長(zhǎng)達(dá)兩個(gè)月的時(shí)間，在黑暗區(qū)域 - 感光
關(guān)鍵的流程步驟
在FISH的過程分為兩個(gè)步驟需要的設(shè)備用于加熱的幻燈片;所述變性步驟和雜交。這些步驟是最FFPE FISH程序相似。
變性：變性的探針和雙鏈DNA
平均時(shí)間：5分鐘
標(biāo)準(zhǔn)溫度：75℃
雜交：探針雜交到靶核酸
時(shí)間范圍：16 - 72小時(shí)
標(biāo)準(zhǔn)溫度：37℃
已經(jīng)孵育好的幻燈片必須儲(chǔ)存在4 - 8°C,直到他們?cè)陲@微鏡下進(jìn)行拍攝。他們可以在這些溫度儲(chǔ)存數(shù)月之久。
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