非特異性條帶？
沒有什么比以多個條帶結(jié)束你的western blot實驗更令人沮喪。 這是我的樣品嗎？ 封閉液的問題？ 抗體的問題？ 如果您正在使用新的樣本或抗體，答案可能是，也不確定。 通過一次更改一個變量，對Western進行故障排除是一個痛苦的過程。 我們不能完全地讓你所有的問題都消失，但這里有一些提示可以幫助你提高你的印跡質(zhì)量。
樣品的問題？
樣品質(zhì)量差是多個條帶的主要來源。 以下是蛋白樣本可能出現(xiàn)的一些常見問題。

• 如果您觀察到多個條帶在預(yù)期分子量下，您的蛋白質(zhì)很可能已經(jīng)降解。 確保在蛋白質(zhì)提取過程中添加蛋白酶抑制劑并保持樣品低溫狀態(tài)。
• 如果條帶大于預(yù)期分子量，請檢查文獻中的磷酸化，糖基化，乙酰化或甲基化等修飾，將蛋白放在更大尺寸的膠中進行跑膠。
• 如果到處都有條帶，您可能加載了過多的樣品，這些樣品會導(dǎo)致對無關(guān)的裂解蛋白非特異性吸附。 在樣品制備方面，不要忘記在上樣前加熱到至少60°C使樣品變性。
• 您的目的蛋白可能與其他蛋白共享表位。 要進行檢查，請運行BLAST搜索以查看目的蛋白的唯一性。
• 另一種可能性是，細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)表達隨著時間的推移而逐漸消失。 如果可以的話，重新開始使用新的非傳代細(xì)胞。

封閉液的問題？
使用錯誤的封閉緩沖液會給你的印跡帶來災(zāi)難。 許多常用的封閉緩沖液可以掩蓋目標(biāo)上的表位，使其難以檢測。 或者是封閉無效產(chǎn)生非特異性結(jié)合。


一抗和二抗的問題？
一抗和二抗也會產(chǎn)生麻煩。 在選擇一抗時，通常有很多選擇。 為獲得最佳結(jié)果，請選擇經(jīng)過親和純化并根據(jù)您的應(yīng)用進行驗證的抗體。 親和純化從制劑中消除了大量非特異性免疫球蛋白，產(chǎn)生更干凈的印跡。 驗證您所選擇的抗體是否已被您的同伴成功使用可查詢抗體搜索引擎，例如CiteAb：https：//www.citeab.com/