2017年4月28日發表于 NANOTECHNOLOGY雜志。

 

最新的貼壁活細胞提取技術——Cytosurge多功能單細胞顯微操作系統FluidFM BOT

 

為什么要進行活細胞提取？
   在傳統的細胞提取技術中往往使用化學、生物學方法將細胞裂解，使細胞內容物滲出從而達到提取目的。但這類方法必須破壞細胞本身，在進行時效研究中，往往要將細胞分組分時處理，這類方法始終無法克服由于細胞異質性帶來的誤差。[1,2]
   全新的活細胞提取技術解決了這一問題。這種技術使用微型注射器能夠從細胞的特定部位每次僅提取極少量的胞質或者胞核（pL級），從而保證細胞活力的同時獲得足夠分析的細胞質或者細胞核，實現對同一細胞不同時間點變化的監測，克服傳統法中由于細胞異質性帶來的誤差。[1,3]

活細胞提取的4種常用技術

1. 納米拖網

   這項技術由Cao等人[2-5]的實驗室建立。在他們的實驗中，他們將150 nm直徑氧化鋁管制成納米拖網。隨后將細胞種植在這種拖網表面。通過這些管道能夠將貼在表面的細胞膜刺破，從而讓細胞內容物滲入到下層的提取緩沖液中，這一方法能夠使約7%內容物滲透入緩沖液中。他們指出這種方法得到的提取液能夠用于熒光蛋白、酶測定以及PCR等試驗。在他們研究中發現使用這種納米拖網對iPSc誘導心肌細胞的中mRNA的提取分析實驗中。他們成功分析出44個mRNA序列，而用傳統裂解方法僅能夠分析出7個。

2. 細胞微注射玻璃針
   細胞微注射玻璃針主要用于對大細胞進行注射。這種方法主要是用0.5~5 μm的玻璃管直接從細胞內抽取內容物。然而這種方法往往會造成細胞損傷，因此目前也有實驗室開發出100 nm的注射針進行提取。[4,6,7]Actis等[4]使用離子電導顯微鏡結合微注射玻璃針建立了fL級細胞內容物提取方法。在這種方法中他們使用一種含有有機相的微注射玻璃針，通過壓力來移動有機相從而實現提取。他們所建立的方法能夠僅提取HeLa細胞內的RNA、線粒體DNA表達物而不提取任何細胞器。

3. FluidFM
   流體力顯微鏡使用中空的原子力探針，通過力學探測精準可控的刺穿細胞膜。隨后通過對施加負壓從而提取細胞。Guillaume-Gentil等報告指出，使用這項技術提取高達90%的細胞胞質的極端條件下，細胞在5天內仍保持較高活力。另外他們還使用該技術同時對細胞核和細胞質進行提取并進行酶測定和PCR實驗取得成功。[1,8]

4. 碳納米管
   碳納米管目前主要應用于低損傷細胞監控中。Singhal等人將50 μm長的多壁碳納米管的末端與微孔玻璃管相連，從而提取胞漿中熒光標記的Ca離子。但是目前該方法提取的體積很小，其應用仍然受到限制。[5]

總結：
   盡管當下有許多其他方法可以評估細胞內環境，包括熒光標記、量子點、納米粒子， FRET，熱敏熒光標記抗體或RNA。這些方法能夠提供高特異性、高對比度和高分辨率，但是都只能識別少量預先設定的目標，無法全面監測細胞內環境變化。同時外源材料的引入也存在著對細胞活力產生不利影響的風險。[3]
   相比之下，細胞活體提取技術有著這些方法無法比擬的優勢。這種技術能夠在全面的監測細胞內環境變化的同時，還能夠盡可能的維持內環境穩定。本文所介紹的4種技術也有各自的優缺點：納米拖網能夠提供較大的細胞提取量，但是無法選擇所需提取的細胞，并且對于不同細胞的提取量差異較大。而細胞微注射玻璃針操作復雜，所需使用的玻璃針會直接影響注射品質。FluidFM技術使用方便，能夠準確定位，但該項技術較新，目前使用人數不多。碳納米管目前仍受制于其提取量的制約，仍有待發展。[9-10]

參考文獻
[1] O. Guillaume-Gentil et al., Cell 166, 506 (2016).
[2] Y. Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E1866 (2017).
[3] J. Liu, J. Wen, Z. Zhang, H. Liu, Y. Sun, Microsys. Nanoeng. 1,15020 (2015).
[4] P. Actis et al., ACS Nano 8, 546 (2014).
[5] R. Singhal et al., Nat. Nanotechnol. 6, 57 (2011).
[6] W. Kang, R. L. McNaughton, H. D. Espinosa, Trends Biotechnol. 34, 665 (2016).
[7] Y. Nashimoto et al., ACS Nano 10, 6915 (2016).
[8] A. Meister et al., Nano Lett. 9, 2501 (2009).
[9] C. Chiappini et al., Nat. Mater. 14, 532 (2015).
[10] A. M. Xu et al., Nat. Commun. 5, 8 (2014).