對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明
對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）
◆ 產品說明
動物病害檢測系列可針對食品、動物組織等樣品中病原的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于對對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的檢測，檢出限為103copies/μL基因組DNA。
- 產品組成（96測試）
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031012 LⅡ | |
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試劑 |
含量 |
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A-WSSV-P |
20μL × 8管× 12排 |
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NG-P |
100μL × 3支 |
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PG-WSSV-P |
100μL × 2支 |
- 適用儀器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。
◆ 自備耗材和儀器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴；⑥均質機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑦電子天平。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：樣本制備區。
2）第二區：模板添加區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆ 樣品處理
①樣品的采集和制備是對蝦白斑綜合癥病毒檢測的重要步驟，為防止交叉污染，應使用一次性消耗品，研缽應經160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應使用1%次氯酸鈉溶液浸泡。②優先采集有癥狀的或活力差的個體。對于成蝦取鰓或上皮、肝胰腺、腸、胃、游泳足或步足等病灶部位，活力差的個體采集10-20尾/池，活力好的個體至少多點采集150尾/池后混勻再隨機抽檢10-20尾。對于幼蝦、仔蝦、幼體或受精卵取整體，活力差的個體至少采集20尾/池，活力好的蝦苗至少采集150尾/池。同一批樣品，建議多點采集合并后，作為一份樣品進行均質，提取DNA。③采樣過程應快速完成，將采取的樣品放入無菌均質袋中均質成糜狀，充分混勻。更多樣品前處理的注意事項可咨詢我司技術支持人員。
- 實驗操作
1.模板制備（樣本制備區）
建議使用配套水生動物病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產品，具體過程詳見產品說明書。
2.添加模板（模板添加區，放置于冰盒上進行）
剪下所需測試數的已含有反應液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-VH-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。
3. 擴增反應（擴增及產物分析區）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。
按下列條件設置擴增反應：
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PCR循環 |
熒光收集位點 | ||
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95℃ |
15分鐘 |
1個循環 |
— |
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95℃ |
15秒 |
40個循環 |
— |
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60℃ |
2分鐘 |
※ | |
其他儀器請參照儀器說明書進行設置。
- 結果判定
檢測樣品無Ct值或≥40，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）或含量低于檢出限；
檢測樣品Ct≤36，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）；
檢測樣品36<Ct≤40，需進行一次重復實驗，若Ct值仍處于36和40之間且呈“S”型擴增曲線，同時陰性對照無Ct值，報告樣品陽性，否則報告樣品陰性。
- NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
