與常規(guī)PCR反應(yīng)相比，實(shí)時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)。

 

武漢英科生物技術(shù)有限公司技術(shù)人員根據(jù)熒光定量PCR原理在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物逐漸增加，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

 

熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值（如下圖所示）。

Ct 值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

 

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值如下圖所示。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

 

 

PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10’SDcycle 6-15

 

 

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù) Real-time PCR詳細(xì)介紹。

 

武漢英科生物技術(shù)有限公司開發(fā)的SYBR實(shí)時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測技術(shù)為國內(nèi)首創(chuàng)，與國際品牌的公司開發(fā)的技術(shù)相比，具有檢測技術(shù)更靈敏，成本更低，實(shí)用性更強(qiáng)的優(yōu)勢。