前言

雜質分析對于藥物的研發(fā)至關重要 1。在研究過程中，雜質譜信息能幫助藥物化學家優(yōu)化合成路線和避免潛在的有毒雜質。在開發(fā)過程中，當大量母體化合物存在時，鑒定和表征痕量雜質至關重要，從而促進了高分辨率、高靈敏度和高掃描速度的 HR-MS 儀器和智能化結構鑒定軟件的發(fā)展。

為了展示 HR-MS 在雜質分析和結構鑒定方面的能力，本文選用了市售藥物奧美拉唑。本研究采用了賽默飛世爾科技的 Q Exactive Focus 臺式 Orbitrap 質譜儀和數據處理軟件 Mass Frontier 來快速分析和鑒定奧美拉唑中雜質的結構。

方法

材料與試劑

奧美拉唑（CAS# 73590-58-6）購自 Sigma-Aldrich，
產品號 O104-100MG。
乙腈和水來自 Fisher Scientific
乙酸銨購自 Sigma-Aldrich，產品號 73594-25G-F。
甲酸購自 Sigma-Aldrich，產品號 33015-500ml。

樣品前處理

奧美拉唑溶液（0.5 mg/mL）配制在 1:1 乙腈 / 水混合溶劑中。

HPLC 方法

色譜分離采用Thermo Scientific Ultimate3000 UHPLC系統(tǒng)。
色譜柱： Thermo Scientific Hypersil GOLD 柱，2.1mm×150mm，粒徑 3 μm.
柱溫： 35 ℃，流速： 0.5 mL/min，進樣體積： 8 μL
流動相： A - 水； B - 乙腈； C -100 mM 乙酸銨，用乙酸調節(jié) pH 值到 5
梯度洗脫：

質譜方法

質譜分析采用 Thermo Scientific Q Exactive Focus 質譜儀的電噴霧正離子模式。在 70,000 和 35,000 分辨率 FWHM@m/z 200 下分別采集高分辨全掃描一級質譜數據和數據依賴二級質譜數據。

離子源條件：
離子化模式：正離子 ESI
離子源： HESI-II
鞘氣流速： 45 單位 N2
輔助氣流速： 10 單位 N2
噴霧電壓（KV）： +3.5
毛細管柱溫度（℃）： 320
S-lens RF 水平： 50.0
加熱器溫度（℃）： 400
Q Exactive Focus 方法參數：
AGC 目標（全掃描）： 3e6
AGC 目標（MS/MS）： 1e5
碰撞能量： 30， 35% 階梯變化
掃描范圍（全掃描 MS）： 180 到 1200 amu

結果與討論

I. 高分辨率全掃描 -HCD MS/MS 鑒定雜質

采集得到奧美拉唑的高分辨率全掃描和三個最高強度的數據依賴 HCD MS/MS 數據。 HRAM 全掃描和MS/MS 數據提供了分子量和碎片信息。 HCD（高能量碰撞解離）得到了豐富的 MS/MS 碎片和低質量端碎片信息。利用 Mass Frontier 軟件與這些信息互相配合，我們不僅快速檢測出奧美拉唑的主要雜質，而且可靠地測定了相應的元素組成，如圖 1&2 和表 1所示。

II. Mass Frontier 用于未知物的結構鑒定

采用Mass Frontier 的“碎片離子搜索”（FISh）功能處理HRAM 全掃描和 MS/MS 數據，見圖 3-a。 FISh 能輕易識別出與母體化合物具有相同碎片離子的化合物，見圖 3-b，并根據碎片推斷出可能的雜質結構，見圖 7。通過搜索 Mass Frontier的 HighChem 譜 圖 數 據 庫， Mass Frontier 的“ Fragment and Mechanism（碎片和機理）”功能可以提供推薦結構的參考文獻。每個推薦結構的“ Fragment and Mechanism”結果對于理解結構來源提供了很好的幫助。將數據結果與“ Fragment andMechanism”進行比較，為推薦結構提供了更多的確認 / 否定標準。

Mass Frontier 的另一個重要特色是“碎片結構的注解圖譜”，用于碎片的自動預測。三個同分異構體的結構鑒定演示了這個功能，見圖 4 和 5。

結論

Q Exactive Focus 臺式 Orbitrap 系統(tǒng)能實現(xiàn)全掃描和 MS/MS 數據的高分辨率準確質量數測定（HRAM），為未知雜質的結構鑒定提供至關重要的分子量和結構信息： HRAM 全掃描準確測定元素組成，而 HRAM MS/MS 能準確測定雜質成分。

Mass Frontier 碎片離子搜索（FISh）和Fragment andMechanism功能，通過搜索 HighChem 碎片數據庫準確鑒定未知物的結構。

由 Q Exactive Focus HRAM 數據和 Mass Frontier 軟件組成的工作流程能幫助研究人員在藥物研究的早期高效準確地鑒定每批次 API 中的雜質。

參考文獻

1. FDD Guidance for Industry, Q3A (R2) Impurities in New Drug Substances