ELISA酶聯(lián)免疫分析

ELISA（酶聯(lián)免疫分析）是很早被應(yīng)用于體液樣本臨床蛋白標(biāo)志物檢測的技術(shù)，因而也被當(dāng)成“金標(biāo)準(zhǔn)”來使用，但事實上受制于較簡單的實驗范式和有限的優(yōu)化措施，ELISA技術(shù)的靈敏度非常有限。而ELISA由于其使用抗體的不同，結(jié)果也會體現(xiàn)不同的檢測效力。粗制多克隆抗體，親和純化的多克隆抗體，和單克隆抗體都在ELISA中有廣泛的應(yīng)用。在構(gòu)建試劑盒時經(jīng)常會需要對抗體的特異性，靈敏度等進行測試。應(yīng)用不同的樣本進行同一個抗體的Western Blot測試可以幫助我們判斷抗體的特異性。對各種來源的抗體進行比較和優(yōu)化，對于開發(fā)ELISA試劑盒，起到最為基礎(chǔ)的作用。

Multiplex多重標(biāo)志物檢測技術(shù)

ELISA技術(shù)已經(jīng)非常成熟且容易掌握，但其靈敏度和檢測通量較低的問題吸引研究者的關(guān)注，并嘗試開發(fā)更好的技術(shù)來替代這種傳統(tǒng)方法。由于大量獲取較廉價數(shù)據(jù)的需要，亦或是在樣本量有限而需要獲得較多數(shù)據(jù)時，多因子或多重分析物同時鑒定的技術(shù)對研究者意義重大。

代表性的多重生物標(biāo)志物檢測技術(shù)包括平面矩陣式檢測和液相懸浮芯片。平面矩陣式檢測以R&D等公司的固相蛋白芯片為代表，通過在固相芯片的不同位置免疫捕獲不同的標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品，來利用空間位置實現(xiàn)不同樣本的識別，而酶標(biāo)二抗所產(chǎn)生的顯色反應(yīng)強弱報告了每個樣本點的特定分析物含量，儀器通過簡便的讀卡就能判斷不同分析物的含量。固相蛋白芯片分析重數(shù)較低以及動力學(xué)范圍較窄的特性使得這項技術(shù)的應(yīng)用受到一定限制，更適合于定性檢測或者相對含量的判斷。

液相懸浮芯片以Luminex平臺為代表，BD等公司的CBA技術(shù)也可以歸為此類。Luminex液相懸浮芯片采用的紅色-紅外雙色/三色染料混合熒光編碼，可以實現(xiàn)約100種/500種不同身份微球的識別。當(dāng)把特定顏色的微球與檢測特定指標(biāo)的抗體偶聯(lián)起來以后，不同微球就可以在同一份樣本中獨立工作，去分別捕獲不同的標(biāo)志物。該技術(shù)所使用的二抗仍然是標(biāo)志物特異性的，上面帶有生物素標(biāo)記，可以同鏈霉親和素-藻紅蛋白顯色劑結(jié)合。因此這項技術(shù)的研發(fā)關(guān)鍵也是要有針對同一抗原分子不同表位的抗體對。在檢測結(jié)果時，與同一份樣本孵育的不同微球會被兩束獨立工作的激光照射。紅色激光用來識別微球的身份，從而告訴儀器正在檢測的是哪種指標(biāo)。另一束綠色激光激發(fā)藻紅蛋白，從而依靠熒光產(chǎn)量判斷分析物含量。CBA與Luminex有較為類似的編碼方式，不同之處在于使用同一束激光來既判斷微球身份，又判斷分析物含量。在熒光補償，儀器調(diào)整方面對操作者提出了更高要求。受制于物理特性，試劑盒檢測分析物的重數(shù)也比較少，一般在10重左右。與此相對，得益于兩束激光的協(xié)同工作，Luminex能把物理干擾減到更低的程度，理論上做到500重的同時檢測都可實現(xiàn)。開發(fā)多重檢測試劑盒的瓶頸不再是光學(xué)特性，而是不同抗體的交叉反應(yīng)。盡管人們嘗試各種辦法盡量減低不同抗體對（antibody pair）的交叉反應(yīng)，但在實際的試劑盒開發(fā)工作中，如果堅持對數(shù)據(jù)質(zhì)量較高的要求，最高可接受的檢測重數(shù)大約在40重左右。當(dāng)液相懸浮芯片應(yīng)用于核酸檢測的時候，由于無需考慮抗體造成的交叉反應(yīng)，檢測重數(shù)可以大大增加。

液相懸浮芯片在實際的檢測工作中具備明顯而有力的價值。首先，液相懸浮芯片在取得接近于ELISA靈敏度的同時，有較大的檢測范圍（實際在3.0-4.5之間），具備較好的檢測效力。其次，在低至25微升樣本中可實現(xiàn)多達40重不同指標(biāo)，能解決大量研究中都會遇到的樣品量和數(shù)據(jù)量之間的矛盾。再次，較低的檢測價格和較少的勞動力投入提高了該技術(shù)受使用者歡迎的程度。最后，在同一份樣品中檢測不同指標(biāo)可以很好的進行樣品內(nèi)不同指標(biāo)的內(nèi)參對照，得到具備獨特價值的數(shù)據(jù)。液相懸浮芯片的不足之處在于靈敏度相對ELISA并無根本突破，而且多指標(biāo)檢測時不同反應(yīng)相互干擾會帶來潛在的數(shù)據(jù)風(fēng)險。因此，對于數(shù)據(jù)要求較高的項目，特別是藥物研發(fā)等醫(yī)藥研究領(lǐng)域，液相懸浮芯片的弱點常常無法忽視。

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