玉米（Zea mays）原產(chǎn)于墨西哥和中美洲地區(qū)，是一種由古印第安人（Indians）在數(shù)千年前利用野生墨西哥類蜀黍（Euchlaenamexicana）（現(xiàn)存在于墨西哥和尼加拉瓜）雜交而來的品種。但是，作為一類重要的糧食作物，天然玉米籽粒在其營養(yǎng)價值上卻有著重要的缺陷。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報道，玉米籽粒中，含量最大的儲藏性蛋白——醇溶蛋白中，賴氨酸和色氨酸這兩種人類必需的氨基酸含量嚴(yán)重缺乏，導(dǎo)致玉米籽粒整體營養(yǎng)價值不佳。因此，如何能夠提高玉米籽粒的營養(yǎng)價值就成為現(xiàn)代社會人類需要解決的一個重要課題。

有報道，玉米籽粒特異的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子Opaque2(O2)在籽粒發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用。Opaque2(o2)突變體相對于野生型籽粒而言表現(xiàn)出了顯著的粉質(zhì)胚乳的表型。有研究表明，O2基因可以結(jié)合22-kD α-zein醇溶蛋白啟動子的O2 motif（TCCACGTAGA）從而調(diào)控該基因家族的表達(dá)。除此之外，19-kD α-zein、14-kD β-zein、27-kD γ-zein和50-kD γ-zein同樣都是O2基因的調(diào)控對象，其最保守的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)門GACGTGG。O2基因在玉米籽粒營養(yǎng)代謝中的價值巨大，與其有關(guān)的方方面面都被人們關(guān)注。但是，其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究卻始終沒有較全面的進(jìn)展，以至于始終沒有深入的挖掘其生物學(xué)功能。

上海大學(xué)的研究人員通過對Opaque2的酵母雙雜交（Yeast two-hybrid screening）技術(shù)對其互作蛋白進(jìn)行篩選以及功能分析，從而對Opaque2調(diào)控下游基因的表達(dá)的理論模型做出了進(jìn)一步的解釋和完善。該研究成果已經(jīng)被國際著名學(xué)術(shù)期刊雜志PLOS Genetics接收，即將在線發(fā)表。該研究是上海大學(xué)通信學(xué)院的博士研究生喬禎逸在宋任濤教授和生命學(xué)院青年教師祁巍巍博士的指導(dǎo)下完成的。該研究中RNA-Seq服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。

研究思路

研究結(jié)果

1.研究人員利用酵母雙雜交技術(shù)對O2蛋白的互作蛋白進(jìn)行篩選，以期望能夠拓展O2在籽粒發(fā)育時期起到的作用機(jī)制。在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中，研究人員篩選到一個屬于MADS類轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白ZmMADS47，并且該蛋白與O2之間的互作通過GST Pull-down、coIP以及凝膠過濾實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證（圖1）。

2.ZmMADS47與O2的表達(dá)譜分析
研究人員對ZmMADS47的全長蛋白以及分段蛋白進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄激活能力的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， ZmMADS47的C端不保守結(jié)構(gòu)域則表現(xiàn)出了極強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活能力（圖2）。該結(jié)果中，ZmMADS47全長則僅僅表現(xiàn)出了較弱的轉(zhuǎn)錄激活能力。這可能是由于ZmMADS47的C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域被全長包裹其中使得其轉(zhuǎn)錄激活能力的不到釋放，而在酵母體系中又缺乏一些能夠使其轉(zhuǎn)錄激活能力得以釋放的因子，從而導(dǎo)致ZmMADS47全長在酵母中相對于玉米籽粒天然狀態(tài)中的構(gòu)型與修飾存在差異，從而影響了全長的轉(zhuǎn)錄激活能力。

3.ZmMADS47 RNAi株系的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析

為了對ZmMADS47 RNAi后整體基因表達(dá)水平進(jìn)行一個大致的了解，研究人員使用了上海伯豪的玉米mRNA高通量測序服務(wù)對ZmMADS47 RNAi籽粒的模式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組層面的研究。GO歸類后發(fā)現(xiàn)，差異基因主要被歸類于營養(yǎng)儲藏類（表一）。
 

4.ZmMADS47 RNAi籽粒的表型觀察

qPCR、SDS-PAGE、Western-blot對醇溶蛋白RNA和蛋白水平的研究發(fā)現(xiàn)，α-zein和50-kD γ-zein的積累量都出現(xiàn)了一定程度的下降。但與o2突變體的opaque表型不同的是，ZmAMDS47 RNAi籽粒中并沒有出現(xiàn)明顯的opaque表型（圖3）。

5.蛋白體大小與形狀在ZmMADS47 RNAi籽粒中發(fā)生變化

研究人員對ZmMADS47 RNAi籽粒進(jìn)行了透射電鏡的觀察，結(jié)果表明，突變體的蛋白體大小分配上出現(xiàn)變化，并且部分蛋白體出現(xiàn)畸形（圖4）。

6.ZmMADS47可以結(jié)合醇溶蛋白啟動子

研究人員對ZmMADS47和醇溶蛋白啟動子的體外結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)，ZmMADS47可以結(jié)合α-zein和50-kD γ-zein的CATGT啟動子，并且和O2一同調(diào)控醇溶蛋白的表達(dá)（圖5）。

7.ZmMADS47促進(jìn)O2調(diào)控醇溶蛋白表達(dá)

ZmMADS47與O2瞬時轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，ZmMADS47本身單獨(dú)不能激活下游靶標(biāo)，而與O2一同轉(zhuǎn)化后，則可以不同程度的增加下游靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄激活能力（圖6）。

8.O2釋放ZmMADS47的轉(zhuǎn)錄激活能力

研究人員通過對ZmMADS47，O2以及50-kD醇溶蛋白的突變研究表明，O2可以通過和ZmMADS47的蛋白互作釋放ZmMADS47 C端的轉(zhuǎn)錄激活能力，從而促進(jìn)下游醇溶蛋白的表達(dá)（圖7）。

討論
本研究中，研究人員通過對Opaque2蛋白的酵母雙雜交篩庫篩選到了一個MIKC亞類的MADS類轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47。對ZmMADS47進(jìn)行RNAi后的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，ZmMADS47同樣對醇溶蛋白存在著調(diào)控關(guān)系。體外DNA－蛋白互作（EMSA）實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZmMADS47對α醇溶蛋白以及50-kD γ-zein有著直接結(jié)合。ZmMADS47與Opaque2的瞬時轉(zhuǎn)錄激活測試表明，Opaque2可以釋放ZmMADS47的轉(zhuǎn)錄激活能力，從而一同增強(qiáng)對α醇溶蛋白以及50-kD γ醇溶蛋白的調(diào)控。該研究成果不僅大大拓展了人們對玉米籽粒醇溶蛋白調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識，還對植物MIKC亞類MADS類轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育過程中的生物學(xué)功能有了進(jìn)一步的延伸。

原文出處：Qiao ZY, Qi WW, Wang Q, et al. ZmMADS47 regulates zein gene transcription through interaction with Opaque2. PLOS Genetics.2016.