自動化核酸提取、檢測和定量平臺

瀏覽次數(shù)：20899　發(fā)布日期：2014-4-11　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

在現(xiàn)今分子生物領(lǐng)域中，樣本的核酸提取、檢測和定量已是每個實驗室常用的實驗手段。近年，實時定量PCR和第二代測序技術(shù)的誕生更令核酸提取的需求大大增加。這些新的核酸檢測技術(shù)對核酸的純度要求比較高，所以核酸提取的質(zhì)量也比以前更受注重。另一方面，準確的核酸定量對于這些新技術(shù)，如第二代測序，起了成敗的關(guān)鍵作用。因此，現(xiàn)今的核酸提取、檢測和定量技術(shù)都跟以往有著重大的改變。

核酸提取

以往核酸提取是采用人手配合試劑盒去進行，由于是人手操作，通量較高的時候往往需要很長時間。而且，基于不同實驗人員的經(jīng)驗和熟練程度有所不同，核酸提取的時間和純度的一致性或許會有分別。面對這些問題，核酸提取的過程開始走向自動化操作以確保提取效果的穩(wěn)定性。在經(jīng)典核酸提取和純化方法中，生物磁珠法最好。該技術(shù)是將純化介質(zhì)包被在納米級生物磁珠表面，通過介質(zhì)對核酸的吸附，在外加磁場下使核酸附著于磁珠定向移動，從而達到固液分離純化的作用。因此，要實現(xiàn)核酸提取自動化，磁珠法是最好的選擇。因為磁珠法的步驟可以完全在移液平臺上進行，而且提取的純度和產(chǎn)量高(每mg磁珠可吸附500μg DNA)，并且可同時進行96個或384個樣本核酸提取。這種方法開始在高通量的實驗室受到重視。市面上有很多磁珠法的核酸提取試劑盒，它們大部份都可以跟移液平臺結(jié)合起來。

核酸檢測和定量

核酸提取以后，下一步就是檢測和定量。對于下游進行第二代測序?qū)嶒�，這一步非常重要。如果定量不準確，會非常影響測序的結(jié)果，導致浪費了高昂的實驗成本。傳統(tǒng)的核酸檢測是采用紫外分光亮度法，通過A260與A280的比值來判定有沒有蛋白質(zhì)的污染。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA的A260/A280比值為2.0。比值升高與降低均表示不純。其中蛋白質(zhì)與在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm與酚在270nm的高吸收峰可以鑒別主要是蛋白質(zhì)的污染還是酚的污染。RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值為1.8的DNA溶液不一定為純的DNA溶液，可能兼有蛋白質(zhì)、酚與RNA的污染，需結(jié)合其它方法加以鑒定。比較精確的方法有熒光定量PCR法和熒光染色法，如PicoGreen、EB、Oligreen等方法，其中以PicoGreen熒光法最為方便和準確。PicoGreen是比較常見用作核酸定量的熒光染料之一，它能夠結(jié)合雙鏈DNA，具有非常好的特異性。PicoGreen跟DNA結(jié)合之后可以利用熒光酶標儀進行高通量測定。



核酸提取和檢測的新趨勢

為了解決通量和一致性的問題，核酸提取和檢測需要更高效和準確的平臺。伯齊科技同時引入了美國移液平臺先驅(qū)－Apricot Desings公司的高通量全自動移液工作站和德國BMG Labtech多功能酶標儀，并聯(lián)合成為自動化核酸提取、檢測和定量平臺。美國Apricot Designs的TPS系列是一個多功能的移液平臺，它不但實現(xiàn)了自動化的移液工作，而且可達到非常好的準確度。在TPS平臺上配合磁珠試劑盒便可進行自動化和高通量的核酸提取，最快可在40分鐘內(nèi)完成480個樣本的核酸提取和純化。除了核酸提取工作外，TPS系統(tǒng)還可進行多種實驗，如PCR、板對板移液、梯度稀釋、ELISA、等。因此，它非常適合高通量和多元化的研究單位。

TPS-EZ自動核酸提取平臺
		裂解：加入200ul樣本、裂解液和蛋白酶K，56度孵育10分鐘

		結(jié)合：加入100ul磁珠、異丙醇混勻后靜置10分鐘，間歇混勻5次

		吸附磁珠：將深孔板移至磁力架上，并吸棄上清

		洗滌：分別加入洗滌液W1A、W2洗滌磁珠，去除磁珠上的蛋白和鹽分

		洗脫：加入洗脫液Eluent A洗脫核酸，可以直接用于如qPCR等實驗

核酸提取和純化后利用紫外光吸引進行檢測，找出比純度較好的樣本，再用PicoGreen熒光染色法進行準確定量。這個檢測和定量的過程便會利用到吸收光和熒光檢測，所以需要一臺靈敏度高和穩(wěn)定性好的多功能酶標儀作為檢測

	工具。德國的BMG Labtech是一家專業(yè)的高端酶標儀廠家，它的多功能酶標儀是歐美各大藥廠的必備儀器。其中它的FLUOstar Omega型號具有獨特的超速分光技術(shù)和高靈敏度的熒光檢測光路，使其非常適合核酸的定量和檢測。
圖1. FLUOstar Omega 220nm-1000nm的全波長檢測

FLUOstar Omega的超速分光計可以以每孔小于1秒的速度把全波長(220nm-1000nm)數(shù)據(jù)記錄下來(圖1)，也就是一瞬間把 260nm、280nm和所有波長的吸收值檢測出來，并把A260/A280自動計算出來。而高靈敏的熒光檢測光路就可使PicoGreen的檢測結(jié)果更準確，由于FLUOstar Omega的熒光靈敏度很好且檢測范圍很寬，從0.39pg到50pg的核酸濃度都有非常好的線性結(jié)果(圖2)。

圖2. 0.39－50pg/ul dsDNA標準曲線

因此，綜合了Apricot Designs的TPS核酸提取儀和 BMG Labtech FLUOstar Omega多功能酶標儀，伯齊科技可以提供一個全面、穩(wěn)定、準確和自動化的核酸提取、檢測和定量平臺。結(jié)合這兩個系統(tǒng)，高通量的核酸提取純化和檢測定量可以很方便簡單地完成。目前為止，很多研究單位和大規(guī)模的測序機構(gòu)都是利用我們這套平臺去解決核酸提取和檢測的問題。這也是高通量分子生物研究的一大趨勢！