感受態制備：酵母感受態細胞制備實驗
酵母感受態細胞制備可以：（1）用于建立酵母轉化體系；（2）用于酵母表達系統構建；（3）用于酵母其他分子生物學研究。
實驗方法
- 化學法
- 試劑盒制備法
| 實驗材料 |
釀酒酵母 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 |
YPDA液體培養基 蒸餾水 甘油 二甲基亞砜 |
| 儀器、耗材 |
培養皿 離心機 離心管 冰箱 |
| 實驗步驟 |
一、試劑與耗材
1. 試劑 細菌用-酵母提取物（Fisher）、 細菌用-蛋白胨（Fisher）、葡萄糖（Fisher）、細菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油(Sigma)、二甲基亞砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸鋰(Sigma)、鮭魚精子細胞DNA(Invitrogen)、酵母無氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-嗎啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。 2. 儀器
水浴鍋(VWR)、離心機(Eppendorf)、30 °C搖床與恒溫培養箱(VWR)、培養皿。
二、 試劑配方
1. YPDA液體或固體培養基
（1）1%酵母提取物： 10 g/L
（2）2%胰蛋白胨： 20 g/L
（3）2%葡萄糖：20 g/L
2. 轉化液
（1）聚乙二醇3350(50 % (w/v)：260 μl
（2）1 M醋酸鋰：36 μl
（3）SsDNA（10 mg/ml）：10 μl
（4）質粒：3 μl
（5）總計：360 μl
3. YNB+ MA 培養基（100 ml）
（1）YNB：0.67 g
（2）2-(N-嗎啉代) 乙磺酸（20mM ）：0.39 g
（3）腺嘌呤：0.01 g
（4）瓊脂粉：2g
（5）葡萄糖：2g 三、制備步驟
1. 在轉化實驗的兩天前，于YPDA培養基的平皿上活化酵母菌株。
2. 轉化前一天，挑取活化的酵母細胞（單克�。┯赮PDA液體培養基中，30°C，200 rpm培養過夜。
3. 將培養過夜的酵母細胞液按1：3的比例轉接與新的YPDA液體培養基中，于30°C搖床內，200 rpm培養4 h。
4. 3 000 g 離心 5分鐘收集酵母細胞，用0.5倍體積的無菌水洗酵母細胞。
5. 再次3 000 g 離心 5分鐘。
6. 用0.01倍體積的無菌水重懸酵母細胞，并轉入適宜的離心管中，20°C ，3 000 g 離心 5分鐘。
7. 用0.01倍體積的無菌細胞懸浮液(5 % v/v 甘油，10% v/v 二甲基亞砜)重懸酵母細胞。
8. 將重懸的酵母細胞按50 ul分裝到1.5 ml離心管中。
9. 將管放入塑料盒或者紙盒中（逐步梯度冷凍能夠增強酵母的存活率）。
10. 將裝有酵母細胞的盒子放入-80°C冰箱。（細胞在-80°C能夠保存一年以上）。 |
| 其他 |
一、參考文獻
1. Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4.
2. Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93. |
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