Lightscanner 和Lightscanner32 非標記探針法基因分型
載脂蛋白（ApoE）多重實驗

密碼子112（T>C）
密碼子158（C>T）

實驗背景

      載脂蛋白（ApoE）是一種糖蛋白，包括299個氨基酸，在身體調節膽固醇水平上起主要作用。膽固醇水平過高是冠心病的主要因素，在美國，冠心病是引起死亡的主要因素。ApoE與老年癡呆癥也有關系，這種病是因為大腦額葉萎縮，造成神經衰弱。老年癡呆癥的普遍表現是癡呆，而且是不能治愈、退化、終端的。ApoE基因有兩個SNPs，位于密碼子112（c.388 T>C）和158（c.526 C>T）。密碼子112和158組合的基因型翻譯3種不同類型的蛋白質，通常稱為：ε3（正常），ε2（異常），和ε4（異常）。
      
                     
• ε2等位基因與高脂蛋白血癥遺傳缺陷類型Ⅲ相連鎖，增加或減少動脈硬化的風險。
• 在群體中，近似于64%的人有ε3等位基因，此等位基因被認為是“中性”的ApoE基因型。
• ε4等位基因與動脈硬化和老年癡呆癥有關系，損害認知功能，減少神經突分支。

方法

      基因分型的同類PCR方法一般需要熒光標記的核苷酸探針，我們用3’端封閉的，非標記探針（Luna Probes）及LC Green飽和染料生成探針下基因型特有的熔解曲線。此方法的關鍵是不平衡PCR引物的比例，此比例導致不對稱PCR或過量產生一條單鏈（實驗中探針的目的鏈），這樣才可以生成足夠的信號。
       需要以下的試劑建立成功來得Lightscanner儀器。

準備樣品

      高分辨率熔解曲線（HRM）對比的是獨立的PCR反應的熔解圖，因此，將反應之間的變化最小化是非常關鍵的。要用HRM分析的樣品必須用相同的提取平臺提取。這樣就排除了不同提取平臺最后洗脫buffer之間的試劑組成的微小不同。做HRM實驗，建議10ul體系基因組DNA模板的含量是10-20ng。

實驗設計

注：帶下劃線的紅色字體顯示的是SNP位點在非標記探針中的位置。“block”顯示的是C3封閉，阻止
探針的3’端延伸。 根據112探針的小的特征，設計其與目的鏈錯配來改變探針的Tm值。這樣允許在同
一反應中，112和158探針的溫度有差異。                                              

反應體系

96孔板操作

按照以下步驟操作：
1. 在每個孔中加25 μL礦物油。
2. 將沒有模板的PCR混合液加入每個孔（9 μL）。
3. 加入DNA模板（每個孔1 μL）。
4. 用封口膜封閉96孔板。
5. 2000-3000rpm離心，至少1分鐘。
      將96孔板放入PCR儀。

擴增Protocol（模塊加熱）

在Lightscanner儀器上掃描樣品，運行以下熔解參數：
起始溫度：50℃；結束溫度：97℃；自動曝光。

擴增Protocol（LS32）

基因分型結果（Lightscanner）

基因分型結果（Lightscanner32）

 
參考文獻
Poulson MD, Wittwer CT. Closed-tube genotyping of apolipoprotein E by isolated-probe PCR with multiple unlabeled probes and high-resolution DNA melting analysis, Biotechniques. 2007;43(1):87–91.