采用UPLC/Xevo G2 QTof對1μM維拉帕米進(jìn)行快速而靈敏的體外代謝物鑒定
目的
使用ACQUITY UPLC®／Xevo™ G2 QTof質(zhì)譜系統(tǒng)及MetaboLynx™ XS應(yīng)用管理軟件，鑒定通過人肝微粒體體外孵育而獲取的1 μM維拉帕米的代謝物。
背景
近年來，隨著越來越多的一線藥品因存在安全性顧慮而退出市場，人們對藥品研發(fā)過程中的藥物代謝和毒性研究給予了更多的關(guān)注。如今，在藥物發(fā)現(xiàn)和研制階段提早進(jìn)行藥物代謝研究的趨勢已比較明顯。普遍的做法是對母體藥物進(jìn)行體外代謝物研究，以便在藥品開發(fā)早期迅速確定其弱點。
在藥物發(fā)現(xiàn)階段進(jìn)行代謝物鑒定的一項挑戰(zhàn)是：需要提供快速而通用的方法，并且該方法應(yīng)足夠靈敏，以使體外孵育研究可在低μM濃度水平下進(jìn)行，從而使其更接近于化合物的體內(nèi)作用情況。
一項典型的體外代謝研究還包括分析母體藥物的代謝速率和途徑。此類研究的理想分析方案需提供在模擬體內(nèi)條件的底物濃度下對代謝物進(jìn)行檢測的分析速度和靈敏度。
利用與UPLC/MSE聯(lián)用的Xevo G2 QTof質(zhì)譜系統(tǒng)，體外代謝物研究可在低μM水平下進(jìn)行，同時具有較好的速度、靈敏度和選擇性。
圖1. 人肝微粒體維拉帕米（1μM）的孵育結(jié)果顯示在MetaboLynx瀏覽器中。
解決方案
將濃度為1 μM的維拉帕米與人肝微粒體在37°C下進(jìn)行孵育，并分別在 0、15、30、60、120和 240分鐘時加入等體積的冷乙腈終止反應(yīng)。對樣品進(jìn)行離心，并取上清液直接進(jìn)樣。
采用沃特世ACQUITY UPLC®系統(tǒng)，ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（1.7 μm、2.1 x 100 mm），進(jìn)行色譜分離。流動相由0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）組成，進(jìn)樣量為5.0 μL。在ESI正離子模式下，使用Xevo G2 QTof質(zhì)譜儀采用UPLC/MSE技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，這樣一次進(jìn)樣即可同時獲取母離子和產(chǎn)物離子的數(shù)據(jù)。
MetaboLynx XS應(yīng)用管理軟件用于進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)果顯示在MetaboLynx瀏覽器中（如圖1所示）。產(chǎn)物離子信息同時進(jìn)行處理，并顯示在MetaboLynx瀏覽器中的碎片分析窗口內(nèi)（圖2）。通過對多個孵育時間點的樣品進(jìn)樣分析，母體藥物的清除曲線和代謝物的形成曲線可在同一次試驗中同時獲取（如圖3所示）。
圖2. 碎片分析窗口中所顯示的MS/MS信息。
圖3. 維拉帕米的清除曲線（3A）及其代謝物的形成曲線（3B）。
通過采用UPLC/MSE 數(shù)據(jù)采集策略，再加上具有化學(xué)智能的MetaboLynx XS數(shù)據(jù)處理工作流程，只需進(jìn)行一次液相色譜進(jìn)樣即可快速完成所有代謝物的鑒定工作。通過在多個時間點進(jìn)樣，可比較容易地獲取低濃度（μM）孵育水平下目標(biāo)藥物的代謝速率和途徑。因此，產(chǎn)能最大化的目標(biāo)即可輕松實現(xiàn)。
總結(jié)
這個應(yīng)用表明：通過使用配備UPLC/MSE 和MetaboLynx XS工作流程的Xevo G2 QTof質(zhì)譜系統(tǒng)，體外代謝物研究可在低濃度（μM）水平下進(jìn)行，同時具有較好的速度、靈敏度和選擇性。
Xevo G2 QTof系統(tǒng)及其創(chuàng)新型QuanTof™和Engineered Simplicity™技術(shù)，與ACQUITY UPLC系統(tǒng)實現(xiàn)了完美結(jié)合。它是目前最靈敏的臺式oaTOF儀器，擁有1 ppm的準(zhǔn)確質(zhì)量測定能力，數(shù)據(jù)采集速度高達(dá)每秒20張光譜圖。
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