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用凍融法制備的Nycodenz予形成梯度分離細胞器

瀏覽次數:3897 發布日期:2008-12-30  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

用密度梯度離心分離亞細胞構造往往需要預先制備蔗糖或其他合適梯度材料的密度梯度,操作比較復雜。利用新型的梯度材料Nycodenz (Norway,Nycomed pharma AS公司)用凍融法制備凸指數與凹指數共存的曲線梯度,利用超速離心機的水平轉頭可以簡便地分離出亞細胞構造中線粒體,高爾基復合體,內質網(滑面及糙面),溶酶體及過氧化酶體。離心分部收集后分別做SDS—PAGE電泳可以明顯地看出細胞器的分布情況。
設備:超速離心機(日立CP—MX,CP—WX或其他品牌新型機)
轉頭:R28S 甩平轉頭
離心管:40PA
密度梯度儀:日立DGF—U用于自上而下從離心管抽出分離液至分部收集器
分部收集器、密度測定設備、電泳儀等常規設備。
樣品:鼠肝勻漿,每管加3.5ml (濃度—14mg/ml )
步驟:
1.Nycodenz梯度制備:
   每管用Nycodenz 稀釋配置液20% w/v (1.105g/ml) 32ml 放入-20℃冰箱凍結。全部凍結后取出室溫中融化即成為(從液面到管底)密度從1.04g/ml 到 1.27/ml 的曲線型      (從 1.05g/ml 到1.13g/ml 為凸指數型,從 1.13g/ml 到1.27g/ml 為凹指數曲線)連續梯度。
2.加樣:在連續梯度上鋪樣品至距管口3mm(約3.5ml)
3.離心:日立R28S甩平轉頭,6×40ml 鈦合金吊桶,40PA管,25,000rpm (82,200xg),4℃離心3小時,加速“8”,減速“7”
4.收集:離心后每管分別用日立DGF—U上取法自動收集至分部收集器也可以人工收集(自上而下),收集管每管約0.5—0.75ml (即40PA 離心管收集成52—78管)
5.測密度:測定每管的密度值,按管數→密度繪成曲線
6.電泳:每管取3 ul 做SDS—PAGE 電泳,并標定管數對應密度及分子量的重疊曲線。
7.分析:根據密度分布可以繪出高爾體復合體,滑面內質網,糙面內質網線粒體,溶酶體及氧化酶微體(注意內質網和微體由于他們的密度及大小不同,可能都會有二個區域的分布)的分布區域,由于它們在Nycodenz 中浮密度的重疊,分布的區域也會有所重疊。

參考文獻:
1.K.Murayama 等  “Electrophoresis”  2001,Vol:22   PP  2872—2880
2.Hitachi KoKi,Scientific Inst.Division,“himac Application” NO:110,2003.1

作者:余興明   電話:13764301893,yuxingming@techcomp.cn


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