NHS活性酯熒光標(biāo)記詳細(xì)步驟、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案指南
標(biāo)記原理
將熒光染料與蛋白，抗體及其他生物分子偶聯(lián)主要基于 NHS 酯反應(yīng)化學(xué)， NHS 酯活化的熒光染料和待標(biāo)記化合物在生理至弱堿性條件下（pH 7至 9）與伯胺反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，反應(yīng)釋放出 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。從而實(shí)現(xiàn)與蛋白，抗體的偶聯(lián)。
圖1 NHS酯化學(xué)偶聯(lián)到伯胺的反應(yīng)圖式
（R）表示具有NHS酯反應(yīng)基團(tuán)的熒光團(tuán)
（P）表示含有伯胺的蛋白質(zhì)，抗體或其他生物分子
標(biāo)記前準(zhǔn)備
1) 實(shí)驗(yàn)物品準(zhǔn)備：移液槍及一次性吸頭（0.5-10μL、2-20μL、20-200μL），恒溫孵育震蕩器，合適離心機(jī)。
2) 準(zhǔn)備活性染料酯母液：粉末一般使用 DMSO 溶解，根據(jù)試劑的溶解性而定。母液應(yīng)分裝低于-20℃保存，避免反復(fù)凍存和受潮。
3) 標(biāo)記緩沖液配制：標(biāo)記實(shí)驗(yàn)請(qǐng)自行準(zhǔn)備合適緩沖液，緩沖液應(yīng)具有適宜的 pH 和成分，例如： 10-50mM 的硼酸鈉溶液，PBS或碳酸氫鈉溶液 (pH 7.5- 8.5)，應(yīng)不包括Tris，氨基酸等含伯胺的物質(zhì)。
4) 純化方式選擇：純化方式試實(shí)驗(yàn)要求可選擇多種方式，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)自行選擇純化方法。純化裝置包括 Zeba 脫鹽離心柱純化，Sephadex G-25 凝膠過(guò)濾柱純化，超濾管純化等。
注：推薦選擇超濾管純化，本司試劑盒產(chǎn)品配置有超濾管，超濾管使用前仔細(xì)請(qǐng)參看 Milipore 官網(wǎng)指南：Amicon Ultra-0.5 mL離心式過(guò)濾器，用于DNA和蛋白的純化及濃縮 - Sample Prep Centrifugal Filter Units (merckmillipore.com)
標(biāo)記步驟
1 置換緩沖液（選擇性操作）
若您的抗體或蛋白濃度較低，或儲(chǔ)備在含有游離氨基的溶液中（Tris，氨基酸等含伯胺的物質(zhì)），標(biāo)記前請(qǐng)用標(biāo)記緩沖液超濾置換抗體溶液。
2 標(biāo)記反應(yīng)量計(jì)算
每種染料標(biāo)記比選擇取決于染料類(lèi)型，蛋白類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模鏲y系列和蛋白最佳標(biāo)記摩爾比在 1:4-1:20 。為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。每個(gè)標(biāo)記反應(yīng)染料的使用量取決于代標(biāo)記蛋白的質(zhì)量，濃度和分子量。在確定好大概摩爾標(biāo)記比的情況下，使用以下公式進(jìn)行計(jì)算染料投量：
● n(染料) 是標(biāo)記抗體Ab或蛋白計(jì)算所用的染料摩爾量；單位 mmol
● m(染料) 是標(biāo)記抗體Ab或蛋白計(jì)算所用的染料質(zhì)量，單位 mg
● a是投料摩爾標(biāo)記比（抗體：染料=1：n）
● m(Ab) 是待標(biāo)記抗體 Ab 或蛋白的總質(zhì)量，單位 mg
● M(Ab) 是抗體或蛋白的分子量，單位 Da
● M(染料) 是所用染料的分子量，單位 g/mol
計(jì)算好染料的摩爾使用量，換算為母液取用量，一般染料母液取用量不超過(guò)反應(yīng)體系的 10% 。
● V(取母液體積) 是所取染料的體積，單位μL
● c(母液濃度),是存儲(chǔ)母液濃度，單位mM
3 以投料比 1:5（蛋白與染料的摩爾比）的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
取出儲(chǔ)存的 2mM 染料母液，染料恢復(fù)至室溫，抗體或蛋白溶液置于 300μL 的標(biāo)記緩沖液反應(yīng)體系，對(duì)于標(biāo)記 0.1mg 的 IgG 抗體（150 KDa），立即取V = 5*0.1*106/（2*150000）μL=6.7μL，加入到體系內(nèi)，震蕩均勻，染料可分多次加入震蕩，然后在室溫避光條件孵育 2 小時(shí)。
4 超濾純化（若使用超濾管）
標(biāo)記反應(yīng)完成后，轉(zhuǎn)移反應(yīng)液后以 12000g 離心超濾15min，去除游離的染料，超濾過(guò)程輕輕混勻溶液，避免觸碰到膜，至少操作超濾 2 次至濾液無(wú)色，最后一次倒置內(nèi)管超濾（4000g，1min），使?jié)饪s后的樣本從超濾內(nèi)管轉(zhuǎn)移到收集內(nèi)管中，得到標(biāo)記好的抗體即可使用，或置于 1%BSA 儲(chǔ)存液避光保存。
圖2 注：最佳標(biāo)記比例可能根據(jù)蛋白的差異而不同，用戶(hù)可根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化。超濾過(guò)程存在膜吸附，不影響后續(xù)使用。
標(biāo)記比及濃度計(jì)算
1）每種染料的偶聯(lián)率在 50%-90%，真實(shí)標(biāo)記比需借助紫外分光光度計(jì)測(cè)試計(jì)算。
2）使用紫外分光光度計(jì)掃描一定稀釋程度的樣本在 230nm~900nm 的吸收光譜，記錄A280的吸光度及染料最大吸收處的吸光度。
3）實(shí)驗(yàn)過(guò)程請(qǐng)注意調(diào)整兩個(gè)吸光度值的大小范圍，使蛋白的 280nm 的吸光度盡量處于 0.1-1 范圍。
4）結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算公式如下：
● Aλmax是染料在最大吸收處的吸光度
● CF是染料對(duì) 280nm 處的吸光度的影響的校正因子，一般取0.03-0.07，參見(jiàn)染料信息
● εdye 和 εAntibody 是染料和抗體的摩爾消光系數(shù)，IgG 抗體 εAntibody 一般 210000 cm-1M-1，εdye 參見(jiàn)染料信息
蛋白濃度公式：
以 BLT 800 標(biāo)記抗體為例標(biāo)記比則為：
標(biāo)記常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
標(biāo)記過(guò)程中蛋白出現(xiàn)帶顏色沉淀
? 蛋白與染料的投料摩爾比過(guò)高（蛋白濃度過(guò)高，染料濃度過(guò)高）
✔ 首先降低投料摩爾比，若仍出現(xiàn)，降低反應(yīng)體系投料蛋白量和相應(yīng)的染料量
? 反應(yīng)體系存在使待標(biāo)記物質(zhì)聚沉的物質(zhì)，可能是蛋白不耐受ph,鹽濃度，被標(biāo)記后在體系聚沉
✔ 改變相應(yīng)條件嘗試
? 染料分子結(jié)構(gòu)特性的水溶性不高
✔ 選擇水溶性更高的染料，例如磺化的染料，但cy的波長(zhǎng)碳鏈越長(zhǎng)越高，水溶性越差，就算磺化后也會(huì)出現(xiàn)一點(diǎn)聚沉，只能通過(guò)其他方式減少聚沉
超濾純化過(guò)程蛋白出現(xiàn)聚沉
? 蛋白不兼容pH
✔ 調(diào)整 pH 在適合范圍
? 超濾過(guò)程蛋白濃度變化太大
✔ 注意一次標(biāo)記的蛋白濃度
超濾純化過(guò)程較慢
? 轉(zhuǎn)速不合適，超濾管截留分子量選擇不當(dāng)
✔ 轉(zhuǎn)速單位調(diào)為 xg 單位，若為 150KDa 的抗體，可更換超濾管 100KDa
蛋白標(biāo)記比較低
? 活性染料儲(chǔ)存使用不當(dāng)，NHS活性酯遇水活性鍵在幾分鐘或幾小時(shí)完全失活，使得無(wú)法標(biāo)記
✔ 活性染料注意防潮，平衡室溫再打開(kāi)
? 標(biāo)記過(guò)程操作細(xì)節(jié)不當(dāng)
✔ 請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整，注意細(xì)節(jié)
? 蛋白緩沖液含有干擾組分如過(guò)量銨離子或含氨基物質(zhì)
✔ 標(biāo)記蛋白前正確置換緩沖液
? 光譜測(cè)定方法不準(zhǔn)確
✔ 請(qǐng)按照正確的吸收光譜方法測(cè)定
較低蛋白回收率
? 超濾膜損破（轉(zhuǎn)速過(guò)高破損）或過(guò)多裝液體漏液
✔ 檢查超濾膜及管芯不要裝過(guò)多液體
? 回收蛋白不當(dāng)
✔ 采取倒置離心回收蛋白
? 標(biāo)記過(guò)程或超濾過(guò)程，蛋白發(fā)生聚沉
✔ 超濾過(guò)程每管降低蛋白濃度，或加入少量氯化銨（20mM）及時(shí)終止反應(yīng)
博鷺騰相關(guān)試劑推薦
Cy系列染料
ATTO系列染料
注：博鷺騰熒光標(biāo)記試劑盒暫時(shí)提供近紅外二區(qū)熒光染料標(biāo)記的全套試劑盒，對(duì)于其他波長(zhǎng)范圍的熒光標(biāo)記，博鷺騰有熒光染料NHS活性酯產(chǎn)品，對(duì)標(biāo)記過(guò)程稍加修改也可做此類(lèi)標(biāo)記。
將熒光染料與蛋白，抗體及其他生物分子偶聯(lián)主要基于 NHS 酯反應(yīng)化學(xué)， NHS 酯活化的熒光染料和待標(biāo)記化合物在生理至弱堿性條件下（pH 7至 9）與伯胺反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，反應(yīng)釋放出 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。從而實(shí)現(xiàn)與蛋白，抗體的偶聯(lián)。
（R）表示具有NHS酯反應(yīng)基團(tuán)的熒光團(tuán)
（P）表示含有伯胺的蛋白質(zhì)，抗體或其他生物分子
標(biāo)記前準(zhǔn)備
1) 實(shí)驗(yàn)物品準(zhǔn)備：移液槍及一次性吸頭（0.5-10μL、2-20μL、20-200μL），恒溫孵育震蕩器，合適離心機(jī)。
2) 準(zhǔn)備活性染料酯母液：粉末一般使用 DMSO 溶解，根據(jù)試劑的溶解性而定。母液應(yīng)分裝低于-20℃保存，避免反復(fù)凍存和受潮。
3) 標(biāo)記緩沖液配制：標(biāo)記實(shí)驗(yàn)請(qǐng)自行準(zhǔn)備合適緩沖液，緩沖液應(yīng)具有適宜的 pH 和成分，例如： 10-50mM 的硼酸鈉溶液，PBS或碳酸氫鈉溶液 (pH 7.5- 8.5)，應(yīng)不包括Tris，氨基酸等含伯胺的物質(zhì)。
4) 純化方式選擇：純化方式試實(shí)驗(yàn)要求可選擇多種方式，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)自行選擇純化方法。純化裝置包括 Zeba 脫鹽離心柱純化，Sephadex G-25 凝膠過(guò)濾柱純化，超濾管純化等。
注：推薦選擇超濾管純化，本司試劑盒產(chǎn)品配置有超濾管，超濾管使用前仔細(xì)請(qǐng)參看 Milipore 官網(wǎng)指南：Amicon Ultra-0.5 mL離心式過(guò)濾器，用于DNA和蛋白的純化及濃縮 - Sample Prep Centrifugal Filter Units (merckmillipore.com)
標(biāo)記步驟
1 置換緩沖液（選擇性操作）
若您的抗體或蛋白濃度較低，或儲(chǔ)備在含有游離氨基的溶液中（Tris，氨基酸等含伯胺的物質(zhì)），標(biāo)記前請(qǐng)用標(biāo)記緩沖液超濾置換抗體溶液。
2 標(biāo)記反應(yīng)量計(jì)算
每種染料標(biāo)記比選擇取決于染料類(lèi)型，蛋白類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模鏲y系列和蛋白最佳標(biāo)記摩爾比在 1:4-1:20 。為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。每個(gè)標(biāo)記反應(yīng)染料的使用量取決于代標(biāo)記蛋白的質(zhì)量，濃度和分子量。在確定好大概摩爾標(biāo)記比的情況下，使用以下公式進(jìn)行計(jì)算染料投量：
● m(染料) 是標(biāo)記抗體Ab或蛋白計(jì)算所用的染料質(zhì)量，單位 mg
● a是投料摩爾標(biāo)記比（抗體：染料=1：n）
● m(Ab) 是待標(biāo)記抗體 Ab 或蛋白的總質(zhì)量，單位 mg
● M(Ab) 是抗體或蛋白的分子量，單位 Da
● M(染料) 是所用染料的分子量，單位 g/mol
計(jì)算好染料的摩爾使用量，換算為母液取用量，一般染料母液取用量不超過(guò)反應(yīng)體系的 10% 。
● c(母液濃度),是存儲(chǔ)母液濃度，單位mM
3 以投料比 1:5（蛋白與染料的摩爾比）的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
取出儲(chǔ)存的 2mM 染料母液，染料恢復(fù)至室溫，抗體或蛋白溶液置于 300μL 的標(biāo)記緩沖液反應(yīng)體系，對(duì)于標(biāo)記 0.1mg 的 IgG 抗體（150 KDa），立即取V = 5*0.1*106/（2*150000）μL=6.7μL，加入到體系內(nèi)，震蕩均勻，染料可分多次加入震蕩，然后在室溫避光條件孵育 2 小時(shí)。
4 超濾純化（若使用超濾管）
標(biāo)記反應(yīng)完成后，轉(zhuǎn)移反應(yīng)液后以 12000g 離心超濾15min，去除游離的染料，超濾過(guò)程輕輕混勻溶液，避免觸碰到膜，至少操作超濾 2 次至濾液無(wú)色，最后一次倒置內(nèi)管超濾（4000g，1min），使?jié)饪s后的樣本從超濾內(nèi)管轉(zhuǎn)移到收集內(nèi)管中，得到標(biāo)記好的抗體即可使用，或置于 1%BSA 儲(chǔ)存液避光保存。
標(biāo)記比及濃度計(jì)算
1）每種染料的偶聯(lián)率在 50%-90%，真實(shí)標(biāo)記比需借助紫外分光光度計(jì)測(cè)試計(jì)算。
2）使用紫外分光光度計(jì)掃描一定稀釋程度的樣本在 230nm~900nm 的吸收光譜，記錄A280的吸光度及染料最大吸收處的吸光度。
3）實(shí)驗(yàn)過(guò)程請(qǐng)注意調(diào)整兩個(gè)吸光度值的大小范圍，使蛋白的 280nm 的吸光度盡量處于 0.1-1 范圍。
4）結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算公式如下：
實(shí)際標(biāo)記比總公式：
● A280是抗體在 280nm 的吸光度● Aλmax是染料在最大吸收處的吸光度
● CF是染料對(duì) 280nm 處的吸光度的影響的校正因子，一般取0.03-0.07，參見(jiàn)染料信息
● εdye 和 εAntibody 是染料和抗體的摩爾消光系數(shù)，IgG 抗體 εAntibody 一般 210000 cm-1M-1，εdye 參見(jiàn)染料信息
蛋白濃度公式：
以 BLT 800 標(biāo)記抗體為例標(biāo)記比則為：
標(biāo)記常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
標(biāo)記過(guò)程中蛋白出現(xiàn)帶顏色沉淀
? 蛋白與染料的投料摩爾比過(guò)高（蛋白濃度過(guò)高，染料濃度過(guò)高）
✔ 首先降低投料摩爾比，若仍出現(xiàn)，降低反應(yīng)體系投料蛋白量和相應(yīng)的染料量
? 反應(yīng)體系存在使待標(biāo)記物質(zhì)聚沉的物質(zhì)，可能是蛋白不耐受ph,鹽濃度，被標(biāo)記后在體系聚沉
✔ 改變相應(yīng)條件嘗試
? 染料分子結(jié)構(gòu)特性的水溶性不高
✔ 選擇水溶性更高的染料，例如磺化的染料，但cy的波長(zhǎng)碳鏈越長(zhǎng)越高，水溶性越差，就算磺化后也會(huì)出現(xiàn)一點(diǎn)聚沉，只能通過(guò)其他方式減少聚沉
超濾純化過(guò)程蛋白出現(xiàn)聚沉
? 蛋白不兼容pH
✔ 調(diào)整 pH 在適合范圍
? 超濾過(guò)程蛋白濃度變化太大
✔ 注意一次標(biāo)記的蛋白濃度
超濾純化過(guò)程較慢
? 轉(zhuǎn)速不合適，超濾管截留分子量選擇不當(dāng)
✔ 轉(zhuǎn)速單位調(diào)為 xg 單位，若為 150KDa 的抗體，可更換超濾管 100KDa
蛋白標(biāo)記比較低
? 活性染料儲(chǔ)存使用不當(dāng)，NHS活性酯遇水活性鍵在幾分鐘或幾小時(shí)完全失活，使得無(wú)法標(biāo)記
✔ 活性染料注意防潮，平衡室溫再打開(kāi)
? 標(biāo)記過(guò)程操作細(xì)節(jié)不當(dāng)
✔ 請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整，注意細(xì)節(jié)
? 蛋白緩沖液含有干擾組分如過(guò)量銨離子或含氨基物質(zhì)
✔ 標(biāo)記蛋白前正確置換緩沖液
? 光譜測(cè)定方法不準(zhǔn)確
✔ 請(qǐng)按照正確的吸收光譜方法測(cè)定
較低蛋白回收率
? 超濾膜損破（轉(zhuǎn)速過(guò)高破損）或過(guò)多裝液體漏液
✔ 檢查超濾膜及管芯不要裝過(guò)多液體
? 回收蛋白不當(dāng)
✔ 采取倒置離心回收蛋白
? 標(biāo)記過(guò)程或超濾過(guò)程，蛋白發(fā)生聚沉
✔ 超濾過(guò)程每管降低蛋白濃度，或加入少量氯化銨（20mM）及時(shí)終止反應(yīng)
博鷺騰相關(guān)試劑推薦
BLTDye 800 標(biāo)記試劑盒
Cy系列染料
AF系列染料
ATTO系列染料
注：博鷺騰熒光標(biāo)記試劑盒暫時(shí)提供近紅外二區(qū)熒光染料標(biāo)記的全套試劑盒，對(duì)于其他波長(zhǎng)范圍的熒光標(biāo)記，博鷺騰有熒光染料NHS活性酯產(chǎn)品，對(duì)標(biāo)記過(guò)程稍加修改也可做此類(lèi)標(biāo)記。
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