摘要
本研究旨在優(yōu)化電穿孔法轉(zhuǎn)染人原代成纖維細(xì)胞的條件，以提高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。通過(guò)調(diào)整電壓、脈沖時(shí)間和細(xì)胞密度等參數(shù)，我們確定了最佳轉(zhuǎn)染條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在特定條件下，轉(zhuǎn)染效率顯著提高，同時(shí)細(xì)胞存活率保持在較高水平。本研究為電穿孔法在基因功能研究和基因治療中的應(yīng)用提供了重要參考。
引言
人原代成纖維細(xì)胞在組織工程、再生醫(yī)學(xué)和基因功能研究中具有重要應(yīng)用。然而，由于其難以轉(zhuǎn)染的特性，如何高效地將外源基因?qū)�入這些細(xì)胞成為研究中的一大挑戰(zhàn)。電穿孔法作為一種非病毒轉(zhuǎn)染方法，因其高效性和簡(jiǎn)便性而備受關(guān)注。然而，電穿孔條件的優(yōu)化對(duì)于提高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率至關(guān)重要。本研究旨在通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，為人原代成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染提供最佳條件。
實(shí)驗(yàn)部分
材料與方法
細(xì)胞培養(yǎng)
人原代成纖維細(xì)胞從皮膚活檢中分離，并在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞在37°C、5% CO₂的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。
質(zhì)粒制備
實(shí)驗(yàn)使用的質(zhì)粒為pEGFP-N1，該質(zhì)粒含有綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因。質(zhì)粒通過(guò)某試劑盒提取，并用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。
電穿孔條件優(yōu)化
電穿孔實(shí)驗(yàn)使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：
1. 電壓優(yōu)化：設(shè)置電壓范圍為100 V至300 V，間隔50 V，每個(gè)電壓條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
2. 脈沖時(shí)間優(yōu)化：在最佳電壓條件下，設(shè)置脈沖時(shí)間為5 ms至20 ms，間隔5 ms，每個(gè)時(shí)間條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
3. 細(xì)胞密度優(yōu)化：在最佳電壓和脈沖時(shí)間條件下，設(shè)置細(xì)胞密度為1×10⁶至5×10⁶ cells/mL，間隔1×10⁶ cells/mL，每個(gè)密度條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)
轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使用熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量分析轉(zhuǎn)染效率。
細(xì)胞存活率檢測(cè)
轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使用某試劑進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。
結(jié)果
電壓優(yōu)化
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著電壓的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸提高，但當(dāng)電壓超過(guò)250 V時(shí)，細(xì)胞存活率顯著下降。因此，250 V被確定為最佳電壓。
脈沖時(shí)間優(yōu)化
在250 V電壓下，脈沖時(shí)間為10 ms時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，同時(shí)細(xì)胞存活率保持在80%以上。因此，10ms被確定為最佳脈沖時(shí)間。
細(xì)胞密度優(yōu)化
在250V電壓和10ms脈沖時(shí)間條件下，細(xì)胞密度為3×10⁶ cells/mL時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，細(xì)胞存活率也保持在較高水平。因此，3×10⁶ cells/mL被確定為最佳細(xì)胞密度。
討論
本研究通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，確定了人原代成纖維細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電壓、脈沖時(shí)間和細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率有顯著影響。在最佳條件下，轉(zhuǎn)染效率顯著提高，同時(shí)細(xì)胞存活率保持在較高水平。這些結(jié)果為電穿孔法在基因功能研究和基因治療中的應(yīng)用提供了重要參考。
結(jié)論
本研究成功優(yōu)化了電穿孔法轉(zhuǎn)染人原代成纖維細(xì)胞的條件，確定了最佳電壓、脈沖時(shí)間和細(xì)胞密度。這些優(yōu)化條件顯著提高了轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率，為人原代成纖維細(xì)胞的基因功能研究和基因治療提供了有效工具。
參考文獻(xiàn)
1. 人永生化表皮細(xì)胞HaCaT電轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化[J].徐珊;杜沖;馬艷民;謝宏俊;高楊;石琦;王新陽(yáng);賀大林;郭鵬,西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）.2014,第4期
2. 人成纖維細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法比較[J].蘆小燕;解慧琪;李莉;智偉;陳曉禾;鄧力,四川大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版.2008,第4期
3. An efficient method for electroporation of small interfering RNAs into ENCODE project tier 1 GM12878 and K562 cell lines[J].,Journal of biomolecular techniques: JBT.2015,第4期
4. Arterial complication of irreversible electroporation procedure for locally advanced pancreatic cancer.[J].Yahya; Ekici;Tugan; Tezcaner;Hüseyin Onur; Ayd?n;Fatih; Boyvat;G?khan; Moray,World Journal of Gastrointestinal Oncology.2016,第10期
5. Direct reprogramming of mouse fibroblasts into cardiac myocytes[J].Inagawa;K.;Ieda;M.,Journal of cardiovascular translational research.2013,第1期
6. Episomal-based generation of an iPS cell line from human fetal foreskin fibroblasts.[J].Peggy; Matz;James; Adjaye,Stem cell research.2016,第期
7. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors.[J].Michalina; Hanzel;Richard J T; Wingate;Thomas; Butts,Journal of visualized experiments: JoVE.2015,第期
8. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions[J].Malin Kele;Kelly Day;Harriet Rönnholm;Jens Schuster;Niklas Dahl;Anna Falk,Stem cell research.2016,第3期
9. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.[J].Artur; Cie?lar-Pobuda;Mehrdad; Rafat;Viktoria; Knoflach;Magdalena; Skonieczna;Andrzej; Hudecki;Andrzej; Ma?ecki;El?bieta; Urasińska;Seaid; Ghavami;Marek J; ?os,Oncotarget.2016,第27期