癌癥等動態(tài)疾病在疾病過程中變得更加異質(zhì)。由于異質(zhì)性，惡性腫瘤可能包含具有不同分子特征的細(xì)胞。這可能導(dǎo)致疾病部位細(xì)胞亞群分布不均勻（空間異質(zhì)性）或同一群體內(nèi)細(xì)胞的分子組成發(fā)生變化（時間異質(zhì)性）。準(zhǔn)確評估異質(zhì)性惡性細(xì)胞對于開發(fā)有效的治療方法至關(guān)重要。藥物開發(fā)的關(guān)鍵步驟是通過確定它們對細(xì)胞靶標(biāo)的親和力以及異質(zhì)天然環(huán)境中相互作用的動力學(xué)來篩選各種候選藥物。深入了解二維受體-配體結(jié)合動力學(xué)對于理解許多生理和病理過程很有幫助，從而為藥物設(shè)計和發(fā)現(xiàn)提供新的策略。

大多數(shù)細(xì)胞群中都存在一定程度的細(xì)胞異質(zhì)性。此外，細(xì)胞間的差異可以顯著改變受體-配體結(jié)合反應(yīng)，并且群體的整體行為可能不代表任何單個細(xì)胞的行為。這種細(xì)胞異質(zhì)性主要由于基因變化、環(huán)境變化和細(xì)胞特性變化而產(chǎn)生。

本應(yīng)用報告重點介紹了 Dong 等人最近研究細(xì)胞異質(zhì)性對結(jié)合動力學(xué)的影響以及使用 SPRm 200（一種表面等離子體共振顯微鏡 (SPRM) 儀器）來測量細(xì)胞異質(zhì)性對群體的影響的研究。SPRM 以其獨特的無標(biāo)記測量每個細(xì)胞的結(jié)合動力學(xué)和表型的能力來解決細(xì)胞異質(zhì)性問題。通過這種方式，可以對細(xì)胞群體進(jìn)行統(tǒng)計分析，以確定結(jié)合相互作用的異質(zhì)范圍（圖 1）并確定結(jié)合相互作用的主要模式。
 

圖 1 (A) 抗 HER2 抗體與異質(zhì) HER2 分子（群體 A - 非糖基化 HER2 和群體 B - 糖基化 HER2）結(jié)合的示意圖。HER2 上包含一級胺基團(tuán)的殘基表示為黑點，N 連接聚糖表示為綠色珠串。已識別 HER2 細(xì)胞外片段上的四個域。在群體 B 中，粘蛋白分子用于表示所有 HER2 鄰近蛋白，例如表皮和胰島素樣生長因子受體。(B) 使用 SPRm 200 對異質(zhì)群體進(jìn)行結(jié)合動力學(xué)測量。

本研究檢查了人表皮生長因子受體 2 (HER2) 蛋白中發(fā)生異常蛋白質(zhì)糖基化所導(dǎo)致的異質(zhì)性，HER2 是酪氨酸激酶受體家族的成員，如圖 1 所示。HER2 在 25–30% 的乳腺癌中過度表達(dá)，可以形成同二聚體或異二聚體（與 HER1、HER3 或 HER4），從而觸發(fā)一系列激酶/AKT 通路。過去，HER2 一直是單克隆抗體藥物赫賽汀和其他抗 HER2 抗體的靶向藥物。一些癌癥患者由于 HER2 受體被聚糖或大型糖蛋白（如 MUC4）掩蓋或物理阻斷而產(chǎn)生赫賽汀耐藥性。據(jù)報道，糖基化的 HER2 與其非糖基化（天然）對應(yīng)物交聯(lián)。粘蛋白 4 (MUC4) 是一種大型且高度糖基化的跨膜蛋白，是可以與 HER2 共定位的幾種蛋白之一。研究表明，像 MUC4 這樣的蛋白的存在會阻礙赫賽汀與 HER2 的結(jié)合。根據(jù) MUC4 和其他表皮和胰島素樣生長因子受體的相對位置，結(jié)合動力學(xué)因細(xì)胞而異。因此，HER2 和糖基化的 HER2 分子相對于其他類型的鄰近蛋白的排列方式可能千差萬別。所有這些都導(dǎo)致了動力學(xué)值的細(xì)胞間差異（異質(zhì)性）甚至亞細(xì)胞位置之間的差異。雖然純化蛋白的動力學(xué)值可以作為藥物開發(fā)的良好指導(dǎo)，但很明顯，使用基于細(xì)胞的方法獲得的結(jié)果更具生物學(xué)意義和藥理學(xué)相關(guān)性，因為它們深入解決了細(xì)胞間差異。

表 1 通過抗 HER2 和天然細(xì)胞內(nèi)形式的 HER2 結(jié)合相互作用測量的動力學(xué)參數(shù)

美國Biosensing Instrument Inc. 的 ImageSPR™ 軟件用于模擬 SPRM 傳感圖和細(xì)胞異質(zhì)性的統(tǒng)計分析。天然 HER2 分子（本研究中也包括糖基化）的動力學(xué)值在不同細(xì)胞之間的差異相對較大。研究表明，細(xì)胞表面蛋白通常被嚴(yán)重糖基化，并且推測這種糖基化可能會影響表位的可及性和藥物與受體蛋白的結(jié)合。本研究中的結(jié)合相互作用遵循典型的 1:2 型動力學(xué)模型，其中與天然受體的相互作用更強，與糖基化受體的結(jié)合較弱（圖 2）。非糖基化細(xì)胞的結(jié)合速率常數(shù) (ka) 更快，這表明糖基化 HER2 上的聚糖阻礙了抗體與結(jié)構(gòu)域 IV 的結(jié)合。
 

圖 2 (A) SKBR 細(xì)胞的明場 (左) 和 SPRM (右) 圖像顯示了分隔參考區(qū)域和細(xì)胞覆蓋區(qū)域的屏障 (紅色虛線) 以及用于獲取 (B) 中代表性傳感圖的 ROI (加粗黃色框)。注入的溶液含有 1.00、5.00、10.0、20.0 和 50.0 nM 抗體，紅色曲線是基于 1:2 結(jié)合模型的模擬傳感圖。

異質(zhì)性是細(xì)胞系統(tǒng)的基本特性，但由于生物體的許多尺度（從單個分子到整個群體）的總體平均值，信息可能會丟失。因此，了解異質(zhì)性是關(guān)鍵，因為它可以作為群體生理學(xué)的有用讀數(shù)和對擾動反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)。此外，了解由于細(xì)胞異質(zhì)性而導(dǎo)致的細(xì)胞動力學(xué)差異（會影響動力學(xué)值的保真度）對于指導(dǎo)藥物發(fā)現(xiàn)過程以及在臨床環(huán)境中評估藥物功效和相關(guān)副作用非常重要。

SPRM 200介紹

• 無標(biāo)記
• 實時定量
• 細(xì)胞膜蛋白原位分析
• 細(xì)胞膜上指定區(qū)域分析
• 電化學(xué)分析