LER現象揭秘之細菌內毒素檢測中的假陰性風險與應對措施
自2013年以來，“低內毒素回收”（LER）現象在細菌內毒素檢測領域引起了廣泛關注。LER描述了在含有螯合緩沖液和聚山梨醇酯的未稀釋單克隆抗體制劑中，觀察到的鱟試劑（LAL）檢測干擾（抑制）。這一現象引發了關于病患者安全和藥典細菌內毒素測試在檢測生物制品中低水平內毒素污染有效性方面的廣泛討論。
一、內毒素與LPS的基本概念
在討論LER現象時，首先需要明確“內毒素”和“脂多糖”（LPS）的概念。
內毒素是革蘭氏陰性細菌外細胞膜的成分，而LPS是內毒素復合物的特定成分，包括脂質A部分，它會引起哺乳動物的致熱反應，并在LAL測試中引發信號產生。LPS是一種兩親性分子，其疏水部分（脂質A）嵌入細胞膜，親水部分（O抗原）暴露于細胞外環境。
二、LER現象的生化與物理基礎
美國藥典（USP）內毒素參考標準品（RSE）和目前與LAL檢測試劑盒相關的所有市售內毒素控制標準品（CSE）都是從各種大腸桿菌菌株中提取和純化的“裸”LPS制劑。
在LAL試驗中，RSE和CSE的劇烈混合是為了確保溶解材料的適當再懸浮，防止LPS吸附在容器表面，并優化LPS的聚集狀態以進行試驗。然而，在LER制劑中，螯合劑和聚山梨醇酯會導致LPS聚集體變小，甚至接近單體狀態，進而降低其生物活性，出現LER現象。
三、LER現象對患者安全與藥典測試的影響
LER現象可能導致LAL檢測出現假陰性結果，從而對患者安全構成隱患。然而，經過改進的工藝控制加上有效的LAL檢測，在工藝過程和釋放檢測中都很好地保證了這些生物制劑的供應安全。
此外，歐盟委員會（EC）和美國藥典（USP）的專家委員會也對LER現象進行了深入研究，并認為當前的藥典測試方法對于檢測生物制品中的內毒素污染是有效的。
四、LER現象的實驗研究與數據支持
多項實驗研究表明，LER現象并不是LAL測試有效性的問題，而是用作對照的加標分析物的選擇以及保持時間研究的實驗設計的問題。
例如，在一項LER制劑保持時間研究中，同時進行了兔子熱原測試（RPT）和LAL檢測，并使用內毒素參考標準品（RSE）和各種實驗室衍生的囊泡制劑（如陰溝腸桿菌、皮氏羅爾斯頓氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和粘質沙雷氏菌）作為加標分析物。在研究開始時（T=0），所有加標制劑在RPT中產生類似熱原反應，且在LAL試驗中完全檢測到。在保持24小時后，囊泡制劑在RPT中仍有反應，LAL檢測回收正常；但RSE在兔熱原試驗和LAL檢測中均無反應，顯示了LER現象的存在。
此外，已發表的數據也表明，在適當的實驗條件下，使用天然內毒素囊泡作為分析物可以克服用RSE或CSE觀察到的LER效應。
五、總結
LER現象揭示了LPS和內毒素雖然在化學、結構和物理上存在差異，但都可能引起相似的反應。因此，在使用“內毒素”一詞時，必須明確其含義。此外，針對LER現象的研究也促使USP提出了一種由天然內毒素組成的新型“天然內毒素”（NOE）標準制劑，以更好地模擬天然內毒素污染的情況，并進一步提高LAL檢測的準確性。
LER現象是一個復雜的問題，涉及多個方面的因素。然而，經過深入研究和實踐驗證，當前的LAL檢測方法在檢測生物制品中的內毒素污染方面仍然是有效的。未來，隨著對LER現象和NOE標準制劑的進一步研究，我們將有望進一步提高內毒素檢測的準確性和可靠性。
一、內毒素與LPS的基本概念
在討論LER現象時，首先需要明確“內毒素”和“脂多糖”（LPS）的概念。
內毒素是革蘭氏陰性細菌外細胞膜的成分，而LPS是內毒素復合物的特定成分，包括脂質A部分，它會引起哺乳動物的致熱反應，并在LAL測試中引發信號產生。LPS是一種兩親性分子，其疏水部分（脂質A）嵌入細胞膜，親水部分（O抗原）暴露于細胞外環境。
二、LER現象的生化與物理基礎
美國藥典（USP）內毒素參考標準品（RSE）和目前與LAL檢測試劑盒相關的所有市售內毒素控制標準品（CSE）都是從各種大腸桿菌菌株中提取和純化的“裸”LPS制劑。
在LAL試驗中，RSE和CSE的劇烈混合是為了確保溶解材料的適當再懸浮，防止LPS吸附在容器表面，并優化LPS的聚集狀態以進行試驗。然而，在LER制劑中，螯合劑和聚山梨醇酯會導致LPS聚集體變小，甚至接近單體狀態，進而降低其生物活性，出現LER現象。
三、LER現象對患者安全與藥典測試的影響
LER現象可能導致LAL檢測出現假陰性結果，從而對患者安全構成隱患。然而，經過改進的工藝控制加上有效的LAL檢測，在工藝過程和釋放檢測中都很好地保證了這些生物制劑的供應安全。
此外，歐盟委員會（EC）和美國藥典（USP）的專家委員會也對LER現象進行了深入研究，并認為當前的藥典測試方法對于檢測生物制品中的內毒素污染是有效的。
四、LER現象的實驗研究與數據支持
多項實驗研究表明，LER現象并不是LAL測試有效性的問題，而是用作對照的加標分析物的選擇以及保持時間研究的實驗設計的問題。
例如，在一項LER制劑保持時間研究中，同時進行了兔子熱原測試（RPT）和LAL檢測，并使用內毒素參考標準品（RSE）和各種實驗室衍生的囊泡制劑（如陰溝腸桿菌、皮氏羅爾斯頓氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和粘質沙雷氏菌）作為加標分析物。在研究開始時（T=0），所有加標制劑在RPT中產生類似熱原反應，且在LAL試驗中完全檢測到。在保持24小時后，囊泡制劑在RPT中仍有反應，LAL檢測回收正常；但RSE在兔熱原試驗和LAL檢測中均無反應，顯示了LER現象的存在。
此外，已發表的數據也表明，在適當的實驗條件下，使用天然內毒素囊泡作為分析物可以克服用RSE或CSE觀察到的LER效應。
五、總結
LER現象揭示了LPS和內毒素雖然在化學、結構和物理上存在差異，但都可能引起相似的反應。因此，在使用“內毒素”一詞時，必須明確其含義。此外，針對LER現象的研究也促使USP提出了一種由天然內毒素組成的新型“天然內毒素”（NOE）標準制劑，以更好地模擬天然內毒素污染的情況，并進一步提高LAL檢測的準確性。
LER現象是一個復雜的問題，涉及多個方面的因素。然而，經過深入研究和實踐驗證，當前的LAL檢測方法在檢測生物制品中的內毒素污染方面仍然是有效的。未來，隨著對LER現象和NOE標準制劑的進一步研究，我們將有望進一步提高內毒素檢測的準確性和可靠性。
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