實驗操作分享之從分子克隆到細胞轉染全解析
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另外，本期投稿活動的獎品除了拍立得、藍牙降噪耳機外，新增《黑神話：悟空》游戲激活碼作為基本獎勵的獎品（耳機與游戲任選一）。
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從分子克隆到細胞轉染全解析
通過表達或者敲低來研究基因對功能的影響是細胞生物學中常用的手段，熒光蛋白的發現也為研究追蹤細胞動態和變化提供了有效的工具。因此將某個基因引入細胞系，或者細胞系中敲除/敲低某個基因不可避免地需要經過轉染這個過程。功能完整的質粒需要從分子克隆開始小心的設計，避免造成功能元件的缺失或者artifacts。本文從分子克隆開始講述如何構建一個在哺乳動物細胞中正常表達的質粒，以及如何將該質粒遞送（轉染）到細胞系中。
分子克隆
分子克隆的目的是把自己想要表達的基因安裝在表達載體上，這樣表達載體轉染進細胞后可以啟動目的基因的表達。因此，表達載體或質粒，需要包含必須的幾個原件來啟動目的基因的表達，同時方便細胞轉染后的篩選。
質粒的基本組成部分
完整的質粒通常包括：啟動子（promoter, 用以啟動目的基因的表達），目的基因(GOI)，終止子（terminator or polyA, 用以終止基因的表達），復制起始位點（ori, 用來質粒的擴增，真核表達載體有的含有兩個復制起始位點包含質粒在大腸桿菌中擴增的ori和f1 ori），抗性基因（用來在大腸桿菌和細胞中篩選陽性克隆）。有的真核細胞表達載體還含有其他原件，用來增強基因表達過程中的穩定性（如AAV載體中的WPRE），方便病毒包裝（AAV和lenti載體中的兩端重復序列），控制多個基因表達（IRES和P2A元件等）。有的還會同時表達熒光蛋白方便后期細胞的篩選。經典的質粒圖譜如下（由SnapGene生成）：
分子克隆
分子克隆類似于打補丁，把其他地方得到的目的基因通過PCR或者酶切的方式得到，并粘貼到一個需要的表達載體上。因此整個過程設計PCR，酶切，片段回收，連接轉化，測序，質粒擴增和抽提。簡短的示意圖以Takara的In Fusion為例：
1 PCR
PCR的目的是為了得到可以用來連接的目的基因，通過兩端引物的擴增得到自己想要的目的序列，在這個過程中可以通過引物的設計添加或者刪除酶切位點，引入突變位點等。需要注意的是，如今市面上多種多樣的高保真酶可以確保堿基突變的概率很低，甚至可以用這些高保真酶擴增長片段，高GC，多序列重復的載體序列。
2 酶切
得到的PCR產物需要插入到自己的表達載體上，通常質粒為超螺旋閉環狀，因此需要合適的限制性內切酶切開對應位點，以方便目的基因的插入。切開的質粒通常需要回收骨架部分，舍棄掉原來位置上的基因。建議使用NEB家的限制性內切酶，沒有星號活性，Buffer基本通用，可以靈活的調節和控制酶切反應及時間。對于沒有想要的酶切位點的載體，可以利用步驟1中的PCR方式獲取。
3 片段回收
為了獲得高純度，去除反應液中的離子，通常需要DNA瓊脂糖凝膠電泳來回收酶切或PCR得到的目的基因和載體（膠回收）。通常最后的洗脫用去離子水或者雙蒸水，以方便下一步的使用。
4 連接轉化
常用的分子克隆手段有很多，如普通的酶切連接（依賴T4 DNA 連接酶），In Fusion (依賴于外切酶)，GoldenGate (依賴TypeIIS型限制性內切酶創造的獨特切口），Gibson組裝（外切酶，聚合酶，連接酶同時作用），CPEC（高保真DNA聚合酶）等。連接轉化后的產物通常轉化到感受態細胞中，以獲得單克隆。
5 測序
重組得到的單克隆菌落有的時候會有錯配或者突變，堿基的缺失等，因此需要挑選單克隆菌落測序。通常測序前會通過菌落PCR和酶切驗證，但是如前所說，現在的DNA高保真聚合酶大大減少了突變的發生，而目前的連接方法組裝正確率都很高，因此為節約時間，我選擇平板隨機挑選兩個菌落送測。
6 質粒擴增和抽提
測序成功的質粒可以重新轉化感受態，挑取單克隆培養后選擇小提/中提/大提質粒。值得注意的是，用于轉染的質粒最好使用去內毒素質粒提取盒。
轉染
轉染前的準備
轉染之前需要準備細胞，一般細胞復蘇后傳1-2代觀察形態和狀態，如果條件嚴格的話還需要檢查是否有支原體污染或者黑膠蟲等。細胞狀態良好的，形態完整活力較好的，匯合度達到80-90%后可以接種細胞。接種細胞前需要計數，有條件的推薦RWD家的細胞計數儀。以293T為例一個示意的形態圖(匯合度>90%)和細胞狀態如下：
▲ 10倍鏡下狀態
轉染
經典的轉染方式包括磷酸鈣，脂質體（以Thermo的lipo2000/3000為代表），PEI （25, 0000 or 40, 000），慢病毒侵染等，每周轉染方式大同小異，具體原理就不一一贅述。以下以經濟實用的PEI轉染為例：
1 準備試劑
無血清培養基(DMEM or opti-MEM), PEI (1mg/mL)，待轉染的DNA質粒。
2 準備DNA-PEI復合物
以24孔板為例，500ng的DNA稀釋到50ul的無血清培養基中，然后按1：3（1μg DNA : 3μL PEI）的比例加入PEI （需要自己調試PEI的比例1：1-1：5，和細胞類型和不停品牌的PEI質量都有一定關系），混勻后靜止15min，一次性將復合物滴入到待轉染的孔。
3（可選）
6-8小時后去除培養基，更換為新鮮的完全培養基（DMEM+10% FBS）。
4 24小時后熒光顯微鏡下觀察轉染結果
通常轉染效率很高，大于90%：
總結
現在的分子克隆和細胞轉染的教程很多，而且很多商家的產品都會有詳細的介紹，從原理到具體操作。本人推薦常用到的幾個網站和學習資源，如SnapGene，Addgene, Takara官網，Thermo和NEB，FuGENE, ATCC。他們基本上是分子和細胞領域的權威和產品創新者，很多國內的產品都是在此基礎上做出來的平替。這些網站無論是在宣傳還是產品介紹上都給出了很權威且詳細的介紹。
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從分子克隆到細胞轉染全解析
分子克隆
質粒的基本組成部分
完整的質粒通常包括：啟動子（promoter, 用以啟動目的基因的表達），目的基因(GOI)，終止子（terminator or polyA, 用以終止基因的表達），復制起始位點（ori, 用來質粒的擴增，真核表達載體有的含有兩個復制起始位點包含質粒在大腸桿菌中擴增的ori和f1 ori），抗性基因（用來在大腸桿菌和細胞中篩選陽性克隆）。有的真核細胞表達載體還含有其他原件，用來增強基因表達過程中的穩定性（如AAV載體中的WPRE），方便病毒包裝（AAV和lenti載體中的兩端重復序列），控制多個基因表達（IRES和P2A元件等）。有的還會同時表達熒光蛋白方便后期細胞的篩選。經典的質粒圖譜如下（由SnapGene生成）：
分子克隆
分子克隆類似于打補丁，把其他地方得到的目的基因通過PCR或者酶切的方式得到，并粘貼到一個需要的表達載體上。因此整個過程設計PCR，酶切，片段回收，連接轉化，測序，質粒擴增和抽提。簡短的示意圖以Takara的In Fusion為例：
1 PCR
PCR的目的是為了得到可以用來連接的目的基因，通過兩端引物的擴增得到自己想要的目的序列，在這個過程中可以通過引物的設計添加或者刪除酶切位點，引入突變位點等。需要注意的是，如今市面上多種多樣的高保真酶可以確保堿基突變的概率很低，甚至可以用這些高保真酶擴增長片段，高GC，多序列重復的載體序列。
2 酶切
得到的PCR產物需要插入到自己的表達載體上，通常質粒為超螺旋閉環狀，因此需要合適的限制性內切酶切開對應位點，以方便目的基因的插入。切開的質粒通常需要回收骨架部分，舍棄掉原來位置上的基因。建議使用NEB家的限制性內切酶，沒有星號活性，Buffer基本通用，可以靈活的調節和控制酶切反應及時間。對于沒有想要的酶切位點的載體，可以利用步驟1中的PCR方式獲取。
3 片段回收
為了獲得高純度，去除反應液中的離子，通常需要DNA瓊脂糖凝膠電泳來回收酶切或PCR得到的目的基因和載體（膠回收）。通常最后的洗脫用去離子水或者雙蒸水，以方便下一步的使用。
4 連接轉化
常用的分子克隆手段有很多，如普通的酶切連接（依賴T4 DNA 連接酶），In Fusion (依賴于外切酶)，GoldenGate (依賴TypeIIS型限制性內切酶創造的獨特切口），Gibson組裝（外切酶，聚合酶，連接酶同時作用），CPEC（高保真DNA聚合酶）等。連接轉化后的產物通常轉化到感受態細胞中，以獲得單克隆。
5 測序
重組得到的單克隆菌落有的時候會有錯配或者突變，堿基的缺失等，因此需要挑選單克隆菌落測序。通常測序前會通過菌落PCR和酶切驗證，但是如前所說，現在的DNA高保真聚合酶大大減少了突變的發生，而目前的連接方法組裝正確率都很高，因此為節約時間，我選擇平板隨機挑選兩個菌落送測。
6 質粒擴增和抽提
測序成功的質粒可以重新轉化感受態，挑取單克隆培養后選擇小提/中提/大提質粒。值得注意的是，用于轉染的質粒最好使用去內毒素質粒提取盒。
轉染
轉染之前需要準備細胞，一般細胞復蘇后傳1-2代觀察形態和狀態，如果條件嚴格的話還需要檢查是否有支原體污染或者黑膠蟲等。細胞狀態良好的，形態完整活力較好的，匯合度達到80-90%后可以接種細胞。接種細胞前需要計數，有條件的推薦RWD家的細胞計數儀。以293T為例一個示意的形態圖(匯合度>90%)和細胞狀態如下：
▲ 10倍鏡下狀態
轉染
經典的轉染方式包括磷酸鈣，脂質體（以Thermo的lipo2000/3000為代表），PEI （25, 0000 or 40, 000），慢病毒侵染等，每周轉染方式大同小異，具體原理就不一一贅述。以下以經濟實用的PEI轉染為例：
1 準備試劑
無血清培養基(DMEM or opti-MEM), PEI (1mg/mL)，待轉染的DNA質粒。
2 準備DNA-PEI復合物
以24孔板為例，500ng的DNA稀釋到50ul的無血清培養基中，然后按1：3（1μg DNA : 3μL PEI）的比例加入PEI （需要自己調試PEI的比例1：1-1：5，和細胞類型和不停品牌的PEI質量都有一定關系），混勻后靜止15min，一次性將復合物滴入到待轉染的孔。
3（可選）
6-8小時后去除培養基，更換為新鮮的完全培養基（DMEM+10% FBS）。
4 24小時后熒光顯微鏡下觀察轉染結果
通常轉染效率很高，大于90%：
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總結
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