巨噬細胞的抗/促炎活性篩選的實驗方法與參考結果
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瑞沃德「 細胞與分子生物新星創作計劃 」火熱進行中，我們將不定期刊登入選文章。除了給廣大細胞分子科研工作者提供一個展示、交流和學習的平臺外，合格文章的作者，也將獲得藍牙降噪耳機等禮品。
以下投稿內容來自中國海洋大學的陳同學，分享巨噬細胞的抗/促炎活性篩選的實驗。
巨噬細胞的抗/促炎活性篩選
巨噬細胞作為天然免疫系統中的細胞，其存活時間長，具備吞噬能力，與中性粒細胞同為感染的第一反應者。該細胞主要參與細胞碎片和病原體的識別、吞噬和降解，向T細胞呈遞抗原以觸發適應性免疫應答。而且，巨噬細胞也能誘導其它抗原呈遞表達共刺激分子，從而啟動適應性免疫反應。
在炎癥早期階段，巨噬細胞會釋放多種細胞因子與趨化因子，以此吸引更多免疫細胞招募至炎癥部位，發揮關鍵作用。
因此，深入研究巨噬細胞對藥物的響應機制，有助于研發新型抗炎療法，特別是針對炎癥相關疾病，如自身免疫性疾病、過敏癥及動脈粥樣硬化等。
實驗方法與參考結果
材料和試劑
• 細胞系：小鼠單核巨噬細胞系Raw264.7
• 試劑：DEME細胞培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)、脂多糖(LPS)、一氧化氮合酶抑制劑(L-NMMA)、細胞因子試劑盒、四噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(MTT)。
抗炎實驗
• 細胞鋪板
將生長狀態良好的Raw264.7細胞，按照5x105個/mL細胞密度接于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2的恒溫培養箱中培養，待細胞生長至50%左右時，用100 μL不含FBS培養基代替舊培養基，饑餓處理12 h后，分為三組：(1) 空白對照組：僅含細胞和培養基；(2) LPS模型組：LPS終濃度為1 μg/mL；(3) 實驗組：分別加入梯度濃度的待測樣品和1 μg/mL的 LPS。每組均設3個復孔，每孔加入DEME完全培養基100 μL。在含5% CO2飽和濕度培養箱中保持37 ℃恒溫培養24 h后，進行RAW264.7細胞形態觀察，并通過MTT法測定細胞活力。
• Griess法檢測NO生成量
細胞處理操作如上所述，饑餓處理12h后，分為四組：
(1) 空白對照組：僅含細胞和培養基；
(2) LPS模型組：LPS終濃度為1 μg/mL；
(3)陽性藥對照組：加入50 μM L-NMMA和1 μg/mL的LPS；
(4) 實驗組：分別加入梯度濃度的待測樣品和1 μg/mL的 LPS。
藥物孵育24 h后，取50 μL上清液，加入另一96孔板中，加入等體積的室溫Griess試劑Ⅰ和試劑Ⅱ，輕輕混勻后，室溫放置10 min， 酶標儀檢測540 nm處吸光度，根據標準曲線計算細胞分泌的NO水平。
NO標準曲線的繪制
以1 mM的NaNO2溶液配制，以dd水稀釋得到5、10、20、40、60、100 μM梯度濃度的標準溶液。取各濃度梯度下的NaNO2溶液50 μL于96孔板中，于室溫下操作，分別加入相同體積的Griess試劑Ⅰ和試劑Ⅱ，輕輕混勻后，放置10 min，酶標儀檢測540 nm處樣品的吸光度，以NO摩爾濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。
計算NO抑制率：NO抑制率=（LPS處理組-實驗組）/LPS處理組×100%
• ELISA試劑盒檢測炎癥因子生成量
細胞處理操作如上所述，將藥物孵育24 h后的細胞，棄掉培養基，以預冷的PBS潤洗3次，洗去殘留的培養基，加入適量細胞裂解液，低溫震蕩裂解10 min。以移液器吹打裂解后的細胞，將裂解液移至離心管中，于4℃下12000 rpm離心5 min。離心后的上清分別采用細胞因子試劑盒進行檢測，可選擇細胞因子種類：COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6。
• qRT-PCR檢測iNOS、TNF-α表達量
細胞處理操作如上所述，將藥物孵育24h后的細胞，棄掉培養基，以預冷的PBS潤洗3次，洗去殘留的培養基，加入Trizol裂解細胞，于無菌環境中提取細胞總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的降解情況。將獲得的未降解RNA作為模板，反轉錄合成cDNA，以所得cDNA為模板，GAPDH為內參，加入對應引物，用SYBR Green Ⅰ熒光染料檢測法進行擴增，檢測細胞中iNOS、TNF-α的mRNA的水平。
• Western Blot檢測NF-κB蛋白及相關因子的表達量
細胞處理操作如上所述，將藥物孵育24 h后的細胞，棄掉培養基，以預冷的PBS潤洗3次，洗去殘留的培養基，加入適量細胞裂解液(裂解液配方：50 μL=40 μL RIPA+5 μL磷酸酶抑制劑+0.5 μL PMSF，每100 mg組織加1 mL裂解液)，于冰上震蕩裂解10min，將裂解液以12000 rpm離心30 min，收集裂解液。BCA測定蛋白含量，根據最低蛋白濃度樣品(不要低于2 mg/mL，5 mg/mL會很好跑出條帶)，以PBS和5X Loading Buffer進行調平。沸水浴10 min滅活，分裝，-80 ℃保存。選擇合適濃度的SDS-PAGE膠分離，每孔上樣40 mg蛋白量（根據調平的蛋白濃度計算上樣體積，注意，上樣體積必須相同且對稱，否則需以loading buffer補齊）。濃縮膠區域時設置電壓60 V，以壓平條帶，進入分離膠區域后設置電壓120 V，臨結束前設置電壓60 V，再次壓平條帶。濕轉蛋白條帶至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌三次后，二抗孵育2 h，PBST洗滌三次，ECL發光顯色觀察，檢測各組蛋白表達量的變化。
促炎實驗
促炎實驗方法與抗炎模式相同，區別在于，設置細胞分組為：
(1) 空白對照組：僅含細胞和培養基；
(2) LPS模型組：LPS終濃度為1 μg/mL；
(3) 實驗組：分別加入梯度濃度的待測樣品，從而比較藥物與LPS的促炎效果。
實驗結果及討論（以促炎實驗為例i）
• 細胞形態觀察
Raw264.7細胞形態主要為圓形。因其對環境非常敏感，在培養時會出現少量短梭形或多角形的分化細胞，而受到藥物處理后，如果藥物具有免疫刺激活性，其分化程度和比例進一步增多，整體表現為梭形，存在明顯觸角。如圖a可見，不做任何處理的巨噬細胞為圓形，隨著藥物濃度升高，更多的細胞形態逐漸變成梭形，觸角伸長，LPS處理組的細胞形態變化明顯。
• NO生成量
LPS作為強免疫原性顆粒，是炎癥模型中廣為應用的誘導劑。NO是一種重要的內源性信號分子，由巨噬細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞產生，具有防御病原體、調節免疫細胞功能、調節免疫代謝、誘導細胞凋亡等重要作用。如圖b可見，LPS處理后NO分泌上調，藥物組的NO分泌量表現出劑量依賴性，說明藥物具有促炎活性。
• TNF-α、IL-6表達量
TNF-α是主要的促炎細胞因子，由多種細胞類型分泌，包括巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、CD4+T細胞和NK細胞，IL-6是一種多效性細胞因子，參與免疫反應以及炎癥、造血、骨代謝和胚胎發育，由淋巴細胞、巨噬細胞和單核細胞分泌產生。如圖d, e可見，藥物表現出與LPS同等效力的TNF-α誘導效果，藥物對IL-6的誘導分泌具有劑量依賴性。
參考文獻
iXu等, 《An Arabinogalactan Isolated from Pollen Typhae Induces the Apoptosis of RKO Cells by Promoting Macrophage Polarization》.
瑞沃德「 細胞與分子生物新星創作計劃 」火熱進行中，我們將不定期刊登入選文章。除了給廣大細胞分子科研工作者提供一個展示、交流和學習的平臺外，合格文章的作者，也將獲得藍牙降噪耳機等禮品。
以下投稿內容來自中國海洋大學的陳同學，分享巨噬細胞的抗/促炎活性篩選的實驗。
巨噬細胞的抗/促炎活性篩選
巨噬細胞作為天然免疫系統中的細胞，其存活時間長，具備吞噬能力，與中性粒細胞同為感染的第一反應者。該細胞主要參與細胞碎片和病原體的識別、吞噬和降解，向T細胞呈遞抗原以觸發適應性免疫應答。而且，巨噬細胞也能誘導其它抗原呈遞表達共刺激分子，從而啟動適應性免疫反應。
在炎癥早期階段，巨噬細胞會釋放多種細胞因子與趨化因子，以此吸引更多免疫細胞招募至炎癥部位，發揮關鍵作用。
因此，深入研究巨噬細胞對藥物的響應機制，有助于研發新型抗炎療法，特別是針對炎癥相關疾病，如自身免疫性疾病、過敏癥及動脈粥樣硬化等。
實驗方法與參考結果
材料和試劑
• 細胞系：小鼠單核巨噬細胞系Raw264.7
• 試劑：DEME細胞培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)、脂多糖(LPS)、一氧化氮合酶抑制劑(L-NMMA)、細胞因子試劑盒、四噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(MTT)。
抗炎實驗
• 細胞鋪板
將生長狀態良好的Raw264.7細胞，按照5x105個/mL細胞密度接于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2的恒溫培養箱中培養，待細胞生長至50%左右時，用100 μL不含FBS培養基代替舊培養基，饑餓處理12 h后，分為三組：(1) 空白對照組：僅含細胞和培養基；(2) LPS模型組：LPS終濃度為1 μg/mL；(3) 實驗組：分別加入梯度濃度的待測樣品和1 μg/mL的 LPS。每組均設3個復孔，每孔加入DEME完全培養基100 μL。在含5% CO2飽和濕度培養箱中保持37 ℃恒溫培養24 h后，進行RAW264.7細胞形態觀察，并通過MTT法測定細胞活力。
• Griess法檢測NO生成量
細胞處理操作如上所述，饑餓處理12h后，分為四組：
(1) 空白對照組：僅含細胞和培養基；
(2) LPS模型組：LPS終濃度為1 μg/mL；
(3)陽性藥對照組：加入50 μM L-NMMA和1 μg/mL的LPS；
(4) 實驗組：分別加入梯度濃度的待測樣品和1 μg/mL的 LPS。
藥物孵育24 h后，取50 μL上清液，加入另一96孔板中，加入等體積的室溫Griess試劑Ⅰ和試劑Ⅱ，輕輕混勻后，室溫放置10 min， 酶標儀檢測540 nm處吸光度，根據標準曲線計算細胞分泌的NO水平。
NO標準曲線的繪制
以1 mM的NaNO2溶液配制，以dd水稀釋得到5、10、20、40、60、100 μM梯度濃度的標準溶液。取各濃度梯度下的NaNO2溶液50 μL于96孔板中，于室溫下操作，分別加入相同體積的Griess試劑Ⅰ和試劑Ⅱ，輕輕混勻后，放置10 min，酶標儀檢測540 nm處樣品的吸光度，以NO摩爾濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。
計算NO抑制率：NO抑制率=（LPS處理組-實驗組）/LPS處理組×100%
• ELISA試劑盒檢測炎癥因子生成量
細胞處理操作如上所述，將藥物孵育24 h后的細胞，棄掉培養基，以預冷的PBS潤洗3次，洗去殘留的培養基，加入適量細胞裂解液，低溫震蕩裂解10 min。以移液器吹打裂解后的細胞，將裂解液移至離心管中，于4℃下12000 rpm離心5 min。離心后的上清分別采用細胞因子試劑盒進行檢測，可選擇細胞因子種類：COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6。
• qRT-PCR檢測iNOS、TNF-α表達量
細胞處理操作如上所述，將藥物孵育24h后的細胞，棄掉培養基，以預冷的PBS潤洗3次，洗去殘留的培養基，加入Trizol裂解細胞，于無菌環境中提取細胞總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的降解情況。將獲得的未降解RNA作為模板，反轉錄合成cDNA，以所得cDNA為模板，GAPDH為內參，加入對應引物，用SYBR Green Ⅰ熒光染料檢測法進行擴增，檢測細胞中iNOS、TNF-α的mRNA的水平。
• Western Blot檢測NF-κB蛋白及相關因子的表達量
細胞處理操作如上所述，將藥物孵育24 h后的細胞，棄掉培養基，以預冷的PBS潤洗3次，洗去殘留的培養基，加入適量細胞裂解液(裂解液配方：50 μL=40 μL RIPA+5 μL磷酸酶抑制劑+0.5 μL PMSF，每100 mg組織加1 mL裂解液)，于冰上震蕩裂解10min，將裂解液以12000 rpm離心30 min，收集裂解液。BCA測定蛋白含量，根據最低蛋白濃度樣品(不要低于2 mg/mL，5 mg/mL會很好跑出條帶)，以PBS和5X Loading Buffer進行調平。沸水浴10 min滅活，分裝，-80 ℃保存。選擇合適濃度的SDS-PAGE膠分離，每孔上樣40 mg蛋白量（根據調平的蛋白濃度計算上樣體積，注意，上樣體積必須相同且對稱，否則需以loading buffer補齊）。濃縮膠區域時設置電壓60 V，以壓平條帶，進入分離膠區域后設置電壓120 V，臨結束前設置電壓60 V，再次壓平條帶。濕轉蛋白條帶至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌三次后，二抗孵育2 h，PBST洗滌三次，ECL發光顯色觀察，檢測各組蛋白表達量的變化。
促炎實驗
促炎實驗方法與抗炎模式相同，區別在于，設置細胞分組為：
(1) 空白對照組：僅含細胞和培養基；
(2) LPS模型組：LPS終濃度為1 μg/mL；
(3) 實驗組：分別加入梯度濃度的待測樣品，從而比較藥物與LPS的促炎效果。
實驗結果及討論（以促炎實驗為例i）
• 細胞形態觀察
Raw264.7細胞形態主要為圓形。因其對環境非常敏感，在培養時會出現少量短梭形或多角形的分化細胞，而受到藥物處理后，如果藥物具有免疫刺激活性，其分化程度和比例進一步增多，整體表現為梭形，存在明顯觸角。如圖a可見，不做任何處理的巨噬細胞為圓形，隨著藥物濃度升高，更多的細胞形態逐漸變成梭形，觸角伸長，LPS處理組的細胞形態變化明顯。
• NO生成量
LPS作為強免疫原性顆粒，是炎癥模型中廣為應用的誘導劑。NO是一種重要的內源性信號分子，由巨噬細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞產生，具有防御病原體、調節免疫細胞功能、調節免疫代謝、誘導細胞凋亡等重要作用。如圖b可見，LPS處理后NO分泌上調，藥物組的NO分泌量表現出劑量依賴性，說明藥物具有促炎活性。
• TNF-α、IL-6表達量
TNF-α是主要的促炎細胞因子，由多種細胞類型分泌，包括巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、CD4+T細胞和NK細胞，IL-6是一種多效性細胞因子，參與免疫反應以及炎癥、造血、骨代謝和胚胎發育，由淋巴細胞、巨噬細胞和單核細胞分泌產生。如圖d, e可見，藥物表現出與LPS同等效力的TNF-α誘導效果，藥物對IL-6的誘導分泌具有劑量依賴性。
參考文獻
iXu等, 《An Arabinogalactan Isolated from Pollen Typhae Induces the Apoptosis of RKO Cells by Promoting Macrophage Polarization》.
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