文獻信息
北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，核醫(yī)學(xué)科，國家藥監(jiān)局放射性藥物研究與評價重點實驗室，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室、貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院等團隊合作的研究成果Construction and Preclinical Evaluation of ¹²⁴I/¹²⁵I‑Labeled Antibody Targeting T Cell Immunoglobulin and Mucin Domain‑3（靶向T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域-3的¹²⁴I/¹²⁵I標(biāo)記抗體的構(gòu)建及臨床前評估）在學(xué)術(shù)期刊《Molecular Pharmaceutics》發(fā)表。平生公司的小動物PET/CT（型號：Super Nova）產(chǎn)品在論文中提供了重要的腫瘤小鼠PET/CT圖像和定量分析。

文獻背景
摘要:T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域3 (TIM3;HAVCR2)是一種跨膜蛋白，對T細胞反應(yīng)施加負調(diào)節(jié)控制。研究表明，TIM3在腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)中的表達上調(diào)。本研究利用雜交瘤技術(shù)制備了一系列靶向TIM3的單克隆抗體。其中，C23表現(xiàn)出良好的生物學(xué)特性。為了實現(xiàn)特異性結(jié)合，作者通過n -溴琥珀酰亞胺(NBS)介導(dǎo)的單克隆抗體C23標(biāo)記開發(fā)了¹²⁴I/¹²⁵I-C23放射性示蹤劑。使用過表達TIM3的293T-TIM3細胞系和親本293T細胞評估結(jié)合親和力和特異性。在HEK293TIM3異種移植模型和4T1-(小鼠乳腺癌細胞)和CT26(小鼠結(jié)腸癌細胞)異體移植模型中檢測¹²⁴I/¹²⁵I-C23的生物分布和體內(nèi)成像。分別在3.7~7.4 MBq ¹²⁴I-C23靜脈給藥后4、24、48、72和/或96小時對模型小鼠進行微PET/CT成像。此外，對解剖腫瘤器官中TIM3的表達進行免疫組化(IHC)染色，并評估腫瘤中相應(yīng)的程序性死亡1 (PD1)、CD3和CD8的表達。C23單克隆抗體(mAb)特異性結(jié)合TIM3蛋白，解離常數(shù)為23.28 nM。成功制備了¹²⁴I-C23和¹²⁵I-C23示蹤劑，標(biāo)記率分別為83.59±0.35%和92.35±0.20%，放射化學(xué)純度超過95.00%。穩(wěn)定性結(jié)果表明，¹²⁴I/¹²⁵I-C23在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和5%人血清白蛋白(HSA)中的放射化學(xué)純度在96 h后仍>80%，293T-TIM3細胞對¹²⁵I-C23的攝取為2.80±0.12%，顯著高于293T細胞(1.08±0.08%)，阻斷組在60和120 min時均顯著阻斷293T-TIM3細胞對¹²⁵I-C23的攝取。體內(nèi)藥代動力學(xué)分析顯示，¹²⁵I-C23的消除時間為14.62h，分布時間為0.4672h。顯微PET/CT成像顯示，293T-TIM3模型¹²⁴I-C23探針攝取與陰性對照組和阻斷組的探針攝取有顯著差異。在人源化小鼠模型中，¹²⁴I-C23探針在4T1和CT26模型中有明顯的特異性攝取，24h時在腫瘤組織中有最大的攝取(4T1和CT26人源化TIM3小鼠腫瘤模型的SUVmax(最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值)分別為0.59±0.01和0.76±0.02)。來自這些小鼠模型的腫瘤組織的免疫組織化學(xué)顯示相似的TIM3表達。TIM3表達的腫瘤組織中也有CD3、CD8細胞和PD-1的表達。TIM3靶向抗體C23具有良好的親和力和特異性。¹²⁴I/¹²⁵I-C23探針在體外和體內(nèi)對TIM3具有明顯的靶向特異性。作者的結(jié)果表明¹²⁴I/¹²⁵I-C23是一種很有前途的TIM3成像示蹤劑，在監(jiān)測免疫檢查點藥物療效方面可能具有很大的潛力。

實驗方法
動物異種移植物模型和顯微PET/CT成像
所有動物實驗均經(jīng)北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。本研究使用健康雌性NOD SCID、BALB/c-nu和KM小鼠均為4~6周齡，TIM3人源化BALB/c小鼠。采用NOD SCID小鼠接種3×10⁶個293T/293T-TIM3細胞構(gòu)建293T/293T-TIM3異種移植模型，BALB/c-nu小鼠接種3×10⁶個A549-TIM3細胞構(gòu)建A549-TIM3異種移植模型，BALB/c小鼠(hTIM3)右腋窩接種4T1或CT26細胞建立異種移植模型。當(dāng)腫瘤體積達到約0.5−1cm³時，進行動物實驗。在0.5%碘化鉀 (KI)溶液阻斷甲狀腺后，異種移植模型和同種異體移植模型通過尾靜脈注射124I-C23 (3.7-7.4 MBq)。然后在不同的時間點進行靜態(tài)PET掃描15分鐘。重建顯微PET數(shù)據(jù)。最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmax)是通過描述每個器官的感興趣區(qū)域(ROI)來估計的。

實驗結(jié)果
將¹²⁴I標(biāo)記的C23單克隆抗體注射到293T和293T-TIM3荷瘤小鼠體內(nèi)，進行微PET/CT成像。在阻斷組中，除¹²⁴I-C23外，向攜帶293T-TIM3的小鼠注射過量的C23抗體。通過正電子發(fā)射斷層掃描(PET)圖像描繪293T和293T-TIM3模型小鼠各器官的ROI，并獲得SUVmax。¹²⁴I-C23被肝臟代謝，更多分布于血管化程度較高的器官，如肝臟和肺(圖4B−4D)，這與生物分布研究的結(jié)果一致。與陰性對照組和阻斷組相比，實驗組293T-TIM3腫瘤組織對探針有明顯的攝取(圖4A)。此外，注射后24h, 293T-TIM3模型腫瘤的SUVmax與阻斷組的SUVmax相比有顯著差異(0.46±0.0047 vs 0.40±0.0163 vs 0.36±0.0082,P < 0.01)(圖4B−4D)。

圖4.腫瘤模型的顯微PET/CT成像。(A)注射¹²⁴I-C23探針后4、24、48、96 h對293T/293T-TIM3異種移植模型進行微PET /CT成像，白色箭頭顯示腫瘤已定位。(B)注射¹²⁴I-C23后不同時間點293T-TIM3模型小鼠各器官的SUVmax;(C)注射¹²⁴I-C23后不同時間點293T模型小鼠各臟器的SUVmax;(D) ¹²⁴I-C23和100mg/kgC23阻斷后293T-TIM3模型小鼠各器官不同時間點的SUVmax。
 

將¹²⁴I-C23注射到A549-TIM3模型進行顯微PET/CT成像(圖5A)，注射后2h測得最高攝量 (SUVmax=0.89±0.0163);此外，A549-TIM3模型的代謝與293T-TIM3模型的代謝一致(圖4A)。此外，A549和A549-TIM3腫瘤區(qū)域的¹⁸F-FDG顯微PET/CT成像顯示SUVmax無顯著差異(圖5B)。

圖5. 腫瘤模型的顯微PET/CT成像。(A)注射124I-C23探針后2、24、48、72、96 h對A549-TIM3異種移植模型進行微PET /CT成像，白色箭頭顯示腫瘤已定位;(B)注射¹⁸F-FDG探針60min后，用Micro-PET/CT對A549/A549-TIM3異種移植模型進行成像，白色箭頭顯示腫瘤已定位。

文獻結(jié)論
在這項研究中，TIM3被證明是預(yù)測性生物標(biāo)志物的可行靶點，而¹²⁵I-C23的體內(nèi)生物分布和藥代動力學(xué)研究可能有助于更好地了解免疫治療反應(yīng)。¹²⁴I-C23的Micro PET/CT成像顯示出良好的腫瘤背景攝取和靶向特異性，這為進一步研究¹²⁴I/¹²⁵I-C23和其他TIM3預(yù)測性生物標(biāo)志物提供了支持。在未來，免疫治療生物標(biāo)志物成像可用于治療監(jiān)測和患者分層。

使用設(shè)備

   
Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）