微生物菌種凍干保藏法具體操作說明
微生物廣泛分布于自然界中的一群肉眼看不到的微小生物，包括細菌、螺旋體、立克次體、衣原體、支原體、放線菌、真菌、病毒等類，其結構簡單，以單細胞、細胞群體或非細胞狀態存在，在提供營養物質和適宜環境的條件下，一般都能獨立生活，迅速生長繁殖。微生物菌種可培養的具有保藏價值的微生物純培養（株）。
微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的。
微生物菌種用各種適宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有形狀基本穩定，以便于研究、交換和使用的目的。微生物菌種常規保藏法分為定期移植保藏法、液體石蠟保藏法、沙土管保藏法、低溫冷凍保藏法和冷凍干燥保藏法5種。
下面來詳細了解微生物菌種凍干保藏方法：
菌種凍干保藏方法亦稱凍干法,是在無菌條件下將欲保藏的菌種制成懸浮液后凍結,在真空條件下使冰升華直至干燥,從而使微生物的生理活動趨于停止面長期維持存活狀態的一種菌種保藏方法。凍干機適用于大多數細菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。生物菌種凍干保存步驟，其操作流程如下：
1、安瓿管準備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。
2、保護劑的選擇和準備
保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。
3、凍干樣品的準備
在適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期，進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》(試行))，與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養的微生物，應離心去除培養基，然后將培養物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。
4、預凍
一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。
5、冷凍干燥
采用凍干機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。
終止干燥時間應根據下列情況判斷：
安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀；
真空度接近空載時的最-高值；
樣品溫度與管外溫度接近；
選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結；
選用一個安瓿管，裝1-2%氯-化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結；
冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內，備用。
6、真空封口及真空檢驗
將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
7、保藏
安瓿管應低溫避光保藏。
8、質量檢查
冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產能力、形態變異、雜菌污染等。
微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的。
微生物菌種用各種適宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有形狀基本穩定，以便于研究、交換和使用的目的。微生物菌種常規保藏法分為定期移植保藏法、液體石蠟保藏法、沙土管保藏法、低溫冷凍保藏法和冷凍干燥保藏法5種。
下面來詳細了解微生物菌種凍干保藏方法：
菌種凍干保藏方法亦稱凍干法,是在無菌條件下將欲保藏的菌種制成懸浮液后凍結,在真空條件下使冰升華直至干燥,從而使微生物的生理活動趨于停止面長期維持存活狀態的一種菌種保藏方法。凍干機適用于大多數細菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。生物菌種凍干保存步驟，其操作流程如下：
1、安瓿管準備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。
2、保護劑的選擇和準備
保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。
3、凍干樣品的準備
在適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期，進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》(試行))，與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養的微生物，應離心去除培養基，然后將培養物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。
4、預凍
一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。
5、冷凍干燥
采用凍干機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。
終止干燥時間應根據下列情況判斷：
安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀；
真空度接近空載時的最-高值；
樣品溫度與管外溫度接近；
選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結；
選用一個安瓿管，裝1-2%氯-化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結；
冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內，備用。
6、真空封口及真空檢驗
將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
7、保藏
安瓿管應低溫避光保藏。
8、質量檢查
冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產能力、形態變異、雜菌污染等。
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