Nature子刊：基于油凝膠脂肪替代物構(gòu)建可食用微載體
衍生的微組織而開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)肉平臺(tái)
 

細(xì)胞培養(yǎng)肉是指通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)的肉類產(chǎn)品，是近年來(lái)興起的細(xì)胞生物學(xué)和組織工程等學(xué)科交叉的新領(lǐng)域。細(xì)胞培養(yǎng)肉的技術(shù)核心基于動(dòng)物細(xì)胞的增殖能力，在體外大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞獲得肌肉、脂肪等組織，再經(jīng)食品化加工生產(chǎn)得到肉類食品。細(xì)胞培養(yǎng)肉的開(kāi)發(fā)旨在解決傳統(tǒng)畜牧業(yè)空間和能源耗費(fèi)巨大、不環(huán)保的弊端，降低對(duì)環(huán)境的影響，提高動(dòng)物福利，并為世界日益增長(zhǎng)的人口提供可用的蛋白質(zhì)來(lái)源。國(guó)內(nèi)部分政策中可以看出未來(lái)可能會(huì)有相關(guān)監(jiān)管條例動(dòng)向：2021年12月24日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《“十四五”全國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村科技發(fā)展規(guī)劃》，也首次提到將細(xì)胞培養(yǎng)肉納入到下一個(gè)五年規(guī)劃當(dāng)中；2022年5月10日，國(guó)家發(fā)改委發(fā)布《“十四五”生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展規(guī)劃》中提出的發(fā)展合成生物學(xué)技術(shù)，探索研發(fā)“人造蛋白”等新型食品，實(shí)現(xiàn)食品工業(yè)迭代升級(jí)，降低傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的環(huán)境資源壓力。
 

2023年5月23日，以色列理工學(xué)院研究人員在期刊Nature Communications（IF: 17.694）發(fā)表了題為“Cultured meat platform developed through the structuring of edible microcarrier-derived microtissues with oleogel-based fat substitute”的研究論文。本研究證明了利用Applikon MiniBio生物反應(yīng)器在可食用微載體上生產(chǎn)細(xì)胞微組織，經(jīng)過(guò)聚集或均質(zhì)加工生成的細(xì)胞塊，被進(jìn)一步嵌入油凝膠脂肪替代物，產(chǎn)生培養(yǎng)肉（CM）原型。
 

動(dòng)物源性肉類中的脂肪成分對(duì)肉制品的味道、口感和質(zhì)地有很大作用，為了模擬CM中脂肪的這些特性，專家學(xué)者開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)了一種脂肪替代物（FS），利用植物油和凝膠劑制備固體結(jié)構(gòu)化的油凝膠來(lái)替代肉制品中的動(dòng)物脂肪。對(duì)于基于油凝膠的FS生產(chǎn)，這里使用基于油凝膠的水包油乳液模板的方法。生產(chǎn)基于油凝膠的基質(zhì)的第一步是產(chǎn)生由蛋白質(zhì)穩(wěn)定的水包油凝膠乳液，油凝膠液滴致密且緊密堆積，平均尺寸為1-3μm，用單硬脂酸甘油酯（GMS）構(gòu)建油滴顆粒，然后進(jìn)行凍干（圖5a）。
 

研究人員展示了一種開(kāi)發(fā)CM產(chǎn)品的新方法，由可食用微載體和油凝膠脂肪替代物組成的CM平臺(tái)（圖1）。優(yōu)化了牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在可食用殼聚糖-膠原微載體上的擴(kuò)增，獲得細(xì)胞微組織；同時(shí)，開(kāi)發(fā)了一種含有植物蛋白的油凝膠系統(tǒng)作為脂肪替代物，其外觀和質(zhì)地可與牛肉脂肪相媲美。研究者們結(jié)合細(xì)胞化微組織和開(kāi)發(fā)的脂肪替代物，介紹了兩種類型的培養(yǎng)肉原型：分層式培養(yǎng)肉和漢堡式培養(yǎng)肉。分層的原型有利于增強(qiáng)硬度，而漢堡樣的原型具有大理石花紋肉樣的外觀和柔軟的質(zhì)地�？傮w而言，該平臺(tái)及其建立的技術(shù)基礎(chǔ)有助于不同培養(yǎng)肉產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，并促進(jìn)其商品化生產(chǎn)。
 

圖1 培養(yǎng)肉平臺(tái)示意圖

牛原代間充質(zhì)干細(xì)胞bMSCs在可食用微載體上的擴(kuò)增培養(yǎng)
 

（1）細(xì)胞接種�？墒秤梦⑤d體以每cm²表面積8000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種，37℃培養(yǎng)。孵育24 h后，用FDA（活細(xì)胞）和PI（死細(xì)胞）染色種子微載體，熒光顯微鏡觀察附著細(xì)胞及其在微載體上的均勻分布。

（2）細(xì)胞擴(kuò)增。使用Applikon MiniBio生物反應(yīng)器（500mL）進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。將種子細(xì)胞微載體與200mL培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器中，溫度37℃，pH 7.2，DO 100%，進(jìn)氣速度1mL/min泵入空氣，為整個(gè)培養(yǎng)體系提供氣源。軟件自動(dòng)調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器的溫度、pH和DO等參數(shù)，使其在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中處于設(shè)定值。
 

為實(shí)現(xiàn)bMSCs在生物反應(yīng)器中的規(guī)�；瘮U(kuò)增，優(yōu)化了以下條件：通氣方式、攪拌速度和補(bǔ)料策略（圖2）：

a．通氣方式：

底部通氣效果不佳，會(huì)產(chǎn)生泡沫，擾亂了微載體的正常懸浮狀態(tài)。而頂通方式泵入空氣，氣體覆蓋反應(yīng)器罐體頂部空間，促進(jìn)氧氣擴(kuò)散到培養(yǎng)基中而沒(méi)有任何負(fù)面影響，因此選用頂通進(jìn)行下一步（圖2a）。

b．?dāng)嚢杷俣龋?/span>

比較了攪拌速度從45rpm逐漸增加到70rpm和從60rpm逐漸增加至80rpm兩種方案（圖2b）。較低的攪拌速度雖然可以使細(xì)胞獲得充足的營(yíng)養(yǎng)和通氣，但從細(xì)胞活力來(lái)看（圖2c），它未能充分懸浮微載體，會(huì)積聚在罐底并形成聚集體（圖2d）。較高的攪拌速度可以充分懸浮微載體，同時(shí)支撐細(xì)胞生長(zhǎng)（圖2a，b）。

c．補(bǔ)料策略：

優(yōu)化了新鮮培養(yǎng)基添加時(shí)間，在培養(yǎng)第3、5和7天更換50%的培養(yǎng)基可以使細(xì)胞獲得充足的營(yíng)養(yǎng)，并及時(shí)降低代謝廢物濃度。
 

圖2 生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)的優(yōu)化。（a）生物反應(yīng)器通氣方式的優(yōu)化；（b）生物反應(yīng)器攪拌速度的優(yōu)化；（c）使用45rpm至70rpm攪拌速度時(shí)，微載體上活/死細(xì)胞的成像。綠色：活細(xì)胞；紅色：死亡細(xì)胞。比例：100μm；（d）以45rpm至70rpm的攪拌速度培養(yǎng)時(shí)，生物反應(yīng)器底部形成的聚集體（箭頭）。
 

使用優(yōu)化后的參數(shù)在生物反應(yīng)器中動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，細(xì)胞更均勻。培養(yǎng)8天后收獲細(xì)胞微載體，免疫熒光染色研究bMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)，其特異性表面標(biāo)記物對(duì)CD29和CD44呈陽(yáng)性，對(duì)CD45呈陰性，為進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，使用流式細(xì)胞術(shù)得到了相同的免疫表型（圖3）。特異的bMSC表面標(biāo)志物在擴(kuò)增后仍保持不變，表明基于微載體的擴(kuò)增培養(yǎng)沒(méi)有誘導(dǎo)干細(xì)胞發(fā)生變化。
 

圖3 bMSC在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增8天后的免疫表型特征
 

采用先進(jìn)的加工方法，以產(chǎn)生的微組織衍生聚集體（圖4）、油凝膠脂肪替代物（圖5）和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TG）交聯(lián)為基礎(chǔ)，進(jìn)一步整合構(gòu)建出兩種CM原型（圖6a）。此外，研究顯示，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)時(shí)，bMSCs可成功地粘附在可食用的殼聚糖-膠原微載體上并增殖，且生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的培養(yǎng)相當(dāng)，為未來(lái)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了可行性的證明。

Applikon MiniBio生物反應(yīng)器可用于干細(xì)胞擴(kuò)增，并能夠?qū)⒓羟辛�和傳質(zhì)系數(shù)轉(zhuǎn)化為工業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器。一般來(lái)說(shuō)，生物反應(yīng)器中的動(dòng)態(tài)攪拌有助于氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的均勻分布并混合，從而適合更大的容器和均勻的條件。對(duì)于工業(yè)規(guī)�；�生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，整個(gè)培養(yǎng)的同質(zhì)性對(duì)于保證產(chǎn)品的可復(fù)制性和標(biāo)準(zhǔn)化具有重要意義。從研究結(jié)果中也可以看出，在擴(kuò)增8天后微載體上的細(xì)胞得到高效的增殖意味著其規(guī)�；�商業(yè)生產(chǎn)的可行性。

圖4 微組織衍生的聚集體
 

圖5 脂肪替代物的生產(chǎn)和表征

圖6 培養(yǎng)肉模型的結(jié)構(gòu)和特征
 

近些年，頭部細(xì)胞培養(yǎng)肉公司的投入重點(diǎn)已逐漸從實(shí)驗(yàn)室走向規(guī)�；�，目前中國(guó)市場(chǎng)也有部分企業(yè)在培養(yǎng)肉領(lǐng)域獲得了一些關(guān)鍵性技術(shù)突破，其中中試規(guī)模工廠從數(shù)量及產(chǎn)能上均有擴(kuò)張趨勢(shì)。細(xì)胞培養(yǎng)工藝過(guò)程的精準(zhǔn)優(yōu)化、高效放大等，是細(xì)胞培養(yǎng)肉規(guī)�；�生產(chǎn)的核心技術(shù)，使用精準(zhǔn)的小型生物反應(yīng)器系統(tǒng)有助于早期工藝開(kāi)發(fā)階段進(jìn)行篩選、優(yōu)化培養(yǎng)基、建模等相關(guān)研究。小型反應(yīng)器具有操作簡(jiǎn)單、通量高、成本低等優(yōu)勢(shì)，能夠較大程度提升工藝開(kāi)發(fā)的效率，降低研發(fā)成本和縮短開(kāi)發(fā)周期。
 

 參考文獻(xiàn) 

◀ 原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-38593-4

◀ Yen FC, Glusac J, Levi S, Zernov A, Baruch L, Davidovich-Pinhas M, Fishman A, Machluf M. Cultured meat platform developed through the structuring of edible microcarrier-derived microtissues with oleogel-based fat substitute. Nat Commun. 2023 May 23;14(1):2942. doi: 10.1038/s41467-023-38593-4. PMID: 37221160; PMCID: PMC10205709.

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